家蠶泛素結(jié)合酶基因BmUbcE2功能的初步研究.pdf

1、泛素-蛋白水解酶復(fù)合體通路又稱之為泛素化途徑，是生物體內(nèi)蛋白降解和修飾的主要途徑之一。泛素結(jié)合酶是泛素-蛋白水解酶復(fù)合體通路中的第二個酶，它在泛素轉(zhuǎn)移和底物特異性識別的過程中發(fā)揮著及其重要的作用。目前，針對于泛素結(jié)合酶的研究主要集中在擬南芥，酵母和哺乳動物（人和小鼠）幾種模式生物上。對于昆蟲泛素結(jié)合酶的研究還不是很廣泛，針對于家蠶的泛素結(jié)合酶研究更是很少見，本實驗室通過熒光差異顯示的技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一段核苷酸片段，經(jīng)過序列比對發(fā)現(xiàn)其具有泛素結(jié)

2、合酶的典型UBC結(jié)構(gòu)域，故命名為BmUbcE2。因此，本研究通過生物信息學(xué)分析、基因的克隆、重組蛋白的原核表達(dá)、抗體的制備、亞細(xì)胞定位、組織分布以及檢測該蛋白在抗BmNPV和易感BmNPV的家蠶品系中病毒感染后表達(dá)量差異幾個方面對目的基因進(jìn)行了鑒定，結(jié)果如下:
　　 ①通過生物信息學(xué)的比對發(fā)現(xiàn)該片段具有泛素結(jié)合酶家族的UBC保守結(jié)構(gòu)域和半胱氨酸活性位點(diǎn)（第111位半胱氨酸）以及泛素結(jié)合酶的完整開放閱讀框，編碼一個183個氨基酸，

3、分子量21KDa的蛋白（預(yù)測等電點(diǎn):6.83）。此外，BmUbcE2定位在家蠶的15號染色體上。多序列比對表明:BmUbcE2與柑橘鳳蝶papilioxuthus(GenBank:BAM19931.1)的同源性最高。通過與已經(jīng)公布的泛素結(jié)合酶進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)BmUbcE2與人的泛素結(jié)合酶UBE2L6在蛋白的三維構(gòu)象上具有高度的相似性。
　　 ②為了了解BmUbcE2基因的生物學(xué)特性，構(gòu)建BmUbcE2原核表達(dá)載體，在大腸桿菌BL2

4、1(DE3)中成功表達(dá)了融合6個組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白，然后用鎳柱純化表達(dá)的蛋白。利用純化的融合蛋白免疫雄性昆明小鼠制備了多克隆抗體。
　　 ③利用該片段的特異性引物和多克隆抗體，在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平上檢測了BmUbcE2在家蠶不同組織中的分布。RT-PCR和Westernblot實驗結(jié)果表明:BmUbcE2廣泛的分布在家蠶的中腸、絲腺、脂肪體、馬氏管、精巢、血淋巴以及蠶蛹中。免疫熒光實驗在家蠶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均檢測到了Bm