棉花泛素結(jié)合酶基因GhUBC2L的功能驗證及棉花CRISPR-Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、蛋白質(zhì)泛素化修飾是細(xì)胞生命活動必不可少的生化過程，被泛素分子標(biāo)記的蛋白往往獲得不同的命運:改變生化活性或者是被蛋白酶體降解。E2泛素結(jié)合酶是蛋白質(zhì)泛素化修飾過程的關(guān)鍵酶之一，它與E3一起決定底物特異性，給底物添加泛素蛋白，維護(hù)泛素鏈形成的持續(xù)性，選擇泛素鏈的連接方式和決定泛素鏈的長短，因此發(fā)揮著重要作用。植物E2蛋白家族成員眾多，相關(guān)功能報道主要集中在擬南芥中，它們廣泛參與植物的光形態(tài)建成、生殖和生長發(fā)育、花期調(diào)控以及各種生物或非生物逆

2、境響應(yīng)等過程，但是在重要經(jīng)濟(jì)作物棉花中鮮有報道。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年來快速發(fā)展的基因組編輯技術(shù)，它能夠?qū)崿F(xiàn)基因的定點編輯，因更具高效性和靈活性而廣受研究者青睞。目前該技術(shù)的主要應(yīng)用是創(chuàng)造特定基因的突變體，然而棉花中很少有突變體材料用于功能基因的遺傳研究，因此在棉花中創(chuàng)建CRISPR/Cas9系統(tǒng)能加快棉花基因功能的研究進(jìn)展。
　　本研究主要內(nèi)容分為兩部分，分別探討棉花E2基因Gh UBC2L的基因功能以及在棉花中創(chuàng)建C

3、RISPR/Cas9系統(tǒng)，主要結(jié)果如下:
　　一、E2基因GhUBC2L參與調(diào)控棉花的器官發(fā)育
　　1.我們在棉花中克隆到一個注釋為E2泛素結(jié)合酶的基因GhUBC2L，核酸和蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)該基因與AtUBC1和AtUBC2高度同源。體外酶活實驗驗證該基因編碼的蛋白具有泛素結(jié)合酶活性，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示它在細(xì)胞內(nèi)所有位置表達(dá)。
　　2.在棉花中對GhUBC2L分別進(jìn)行超表達(dá)和RNAi干涉，獲得的基因干涉植株表現(xiàn)為植株生

4、長變緩，包括葉片、花和成熟種子在內(nèi)的器官變小，纖維發(fā)育也受阻，超表達(dá)植株的葉片和花器官明顯增大。細(xì)胞水平檢測發(fā)現(xiàn)，GhUBC2L可能通過調(diào)控細(xì)胞的增殖和膨大來決定器官的大小。
　　3.通過酵母雙雜交實驗，篩選到與GhUBC2L互作的蛋白GhUbox8，體內(nèi)和體外實驗證實兩者發(fā)生互作。體外酶活實驗證實GhUbox8具有E3泛素連接酶活性，同時自身能夠-形成二聚體。檢測轉(zhuǎn)基因材料間的組蛋白修飾狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)干涉植株中H2Bub和H3K4m

5、e3修飾水平均顯著下降，H2Bub水平下調(diào)格外明顯，但是還沒有建立GhUbox8與組蛋白修飾的聯(lián)系。
　　4.對關(guān)鍵基因表達(dá)量檢測，發(fā)現(xiàn)JA合成關(guān)鍵基因LOX1，發(fā)育相關(guān)基因MADS1在干涉中顯著下調(diào)。最后推測，GhUBC2L可能與包括GhUbox8在內(nèi)的多個E3連接酶互作，參與不同組蛋白的泛素化修飾，調(diào)控關(guān)鍵的發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控棉花的正常生長發(fā)育。
　　二、棉花中CRISPR/Cas9系統(tǒng)的建立
　　1.我

6、們在棉花中克隆到與擬南芥AtU6-26同源的U6啟動子，用于改造能夠同時串聯(lián)多個sgRNA靶標(biāo)的CRISPR/Cas9表達(dá)載體。分別對棉花中異源表達(dá)的基因DsRED2和棉花內(nèi)源基因GhCLA1設(shè)計多個sgRNA打靶位點，構(gòu)建載體并進(jìn)行棉花遺傳轉(zhuǎn)化。
　　2.靶向DsRED2的6個sgRNA位點均能夠被編輯，編輯類型以堿基缺失為主。DsRED2基因被敲除的棉花在各個組織中均丟失了紅色熒光，紅色種子也恢復(fù)成野生型狀態(tài)。遺傳分析發(fā)現(xiàn)，T

7、0代產(chǎn)生的突變基因型和表型均能夠穩(wěn)定遺傳至T1代，而且對沒突變的位點能產(chǎn)生持續(xù)編輯。
　　3.靶向GhCLA1的4個sgRNA位點均能夠被編輯，編輯類型以堿基缺失為主。載體上的兩個sgRNA能夠同時作用于目的基因，并產(chǎn)生大片段缺失。GhCLA1基因被敲除后產(chǎn)生明顯的白化植株，生長發(fā)育受到嚴(yán)重的影響，該表型產(chǎn)生效率達(dá)到75％。通過分析多個單株的靶標(biāo)位點基因型和表型發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生完全白化的表型需要敲除GhCLA1的所有拷貝。
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