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1、蛋白激酶是負(fù)責(zé)催化磷酸基團(tuán)向絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的轉(zhuǎn)移,在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用,在對(duì)體內(nèi)各種生理活動(dòng)調(diào)控中扮演重要角色。RIOK3含有一個(gè)RIO結(jié)構(gòu)域,是人類RIO蛋白激酶家族成員,但是其結(jié)構(gòu)與其他RIO家族成員結(jié)構(gòu)上差別較大。關(guān)于人類RIO家族的功能尚未見報(bào)導(dǎo),本文首次對(duì)人類RIO家族成員功能進(jìn)行了研究。
通過細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RIOK3定位于細(xì)胞質(zhì)中,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)RIOK3野生型和
2、突變體對(duì)細(xì)胞周期都沒有影響。為了研究RIOK3的功能和分子機(jī)制,利用酵母雙雜交篩選首次得到四個(gè)與RIOK3相互作用的蛋白:CASP10(caspase-10),BIM(Bcl-2 interacting mediator),PAK2(p21-activated kinase 2)和CDC42(cell division cycle 42。本文著重對(duì)RIOK3與CASP10和BIM的相互作用進(jìn)行了深入研究。
CASP10是凋
3、亡途徑中的起始者,其N端兩個(gè)DED結(jié)構(gòu)域可以激活NFκB信號(hào)通路。本文首先利用GSTpull-down實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞內(nèi)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和熒光共定位實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了RIOK3和CASP10的相互作用。隨后通過系列缺失實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RIOK3的RIO結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了它和CASP10的相互作用,RIOK3可以同時(shí)和CASP10的N端和C端的兩個(gè)DED結(jié)構(gòu)域相互作用,單獨(dú)的RIO結(jié)構(gòu)域不能與任何一個(gè)DED結(jié)構(gòu)域相互作用,需要其N端序列的協(xié)助。為了驗(yàn)證相互作用的
4、特異性,用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了其他含有RIO結(jié)構(gòu)域或者兩個(gè)DED結(jié)構(gòu)域而且結(jié)構(gòu)上非常相似的蛋白與對(duì)應(yīng)蛋白的相互作用情況,均未發(fā)現(xiàn)相互作用。根據(jù)RIOK3與CASP10相互作用的提示,本文首次發(fā)現(xiàn)了RIOK3作為一個(gè)NFκB通路的新成員可以抑制TNFα誘導(dǎo)的NFκB的活化并證明了這種抑制效應(yīng)是通過RIOK3與CASP10的相互作用而實(shí)現(xiàn)的:當(dāng)轉(zhuǎn)入不與CASP10相互作用的RIOK3的截短體RIOK3N1時(shí),抑制效應(yīng)就會(huì)消失,而當(dāng)轉(zhuǎn)入能與C
5、ASP10相互作用的截短體RIOK3N2時(shí),抑制效應(yīng)又得到恢復(fù)。本文又進(jìn)一步證明RIOK3之所以與CASP10相互作用后抑制NFκB通路的激活是因?yàn)镽IOK3可以與RIP和NIK競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CASP10,從而抑制CASP10在NFκ3通路中的作用。本文還首次發(fā)現(xiàn)了RIOK3也可以抑制RIP和NIK對(duì)NFκB通路的激活,可能也是因?yàn)镽IOK3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CASP10而引起的。
BIM是一種只含一個(gè)BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白,BIM的活化
6、可以促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。本文利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和熒光共定位實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了RIOK3和BIM的相互作用。本文還首次發(fā)現(xiàn)了BIM能特異性地促進(jìn)RIOK3蛋白降解,但不促進(jìn)無(wú)關(guān)蛋白PAK2降解。本文通過將RIOK3與BIM共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞中表達(dá)蛋白的增多,BIM促進(jìn)RIOK3的降解作用也越來(lái)越明顯,但BIM促進(jìn)RIOK3的降解并不依賴于泛素化-蛋白酶體途徑。
本論文通過對(duì)RIOK3的功能研究,首次發(fā)現(xiàn)了RIOK3在NFκ
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