復(fù)元膠囊通過DDR2對(duì)軟骨細(xì)胞肥厚分化影響的研究.pdf

1、目的:本課題主要研究復(fù)元膠囊通過抑制Ⅱ型膠原-盤狀結(jié)構(gòu)域受體2(typeⅡ collagen-discoidin domain receptor2,COLⅡ-DDR2)在骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）關(guān)節(jié)軟骨中的表達(dá)而影響軟骨細(xì)胞肥厚分化的機(jī)制。通過培養(yǎng)大鼠肋軟骨原代細(xì)胞，構(gòu)建重組質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，檢測(cè)不同DDR2表達(dá)情況下軟骨細(xì)胞肥厚標(biāo)志物基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinases13

2、，MMP13)、X型膠原(type Xcollagen，COL X)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的mRNA及蛋白表達(dá)情況;研究在p38、MEK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑的作用下，軟骨細(xì)胞內(nèi)肥厚相關(guān)蛋白的表達(dá)情況、復(fù)元膠囊含藥血清對(duì)COLⅡ-DDR2引起的肥厚軟骨細(xì)胞模型表達(dá)目標(biāo)蛋白的影響。以此探討COLⅡ-DDR2對(duì)軟骨細(xì)胞肥厚分化的影響、DDR2細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和下游分子效應(yīng)、復(fù)元膠囊對(duì)軟骨細(xì)胞肥厚的作用，為

3、OA的發(fā)病機(jī)制尋找實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以及為OA的藥物干預(yù)提供參考。
　　方法:
　　1.按照mankens評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，選取重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院關(guān)節(jié)置換病人關(guān)節(jié)軟骨，對(duì)OA早期標(biāo)本進(jìn)行HE及免疫組化染色，確定COLⅡ、DDR2在OA患者關(guān)節(jié)內(nèi)是否表達(dá);采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)、蛋白免疫印跡(Western-blot)檢測(cè)DDR2的mRNA和蛋白在OA軟骨的表達(dá)。
　　2.大鼠肋軟骨細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定，

4、用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)DDR2表達(dá)上調(diào)，構(gòu)建含有全長DDR2基因（Full lengthe DDR2，F(xiàn)D）及僅含有細(xì)胞外結(jié)構(gòu)(discoidin domain，DS)基因的克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌成功后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選菌落酶切并連接表達(dá)質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞。
　　3.轉(zhuǎn)染成功后用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)肥厚軟骨細(xì)胞模型，并檢測(cè)相應(yīng)的肥厚markers，即ALP、MMP13、COLX的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　4.采用p38通路抑制劑SB

5、203580和MEK通路抑制劑PD98059、Wnt信號(hào)通路抑制劑Dkk1孵育軟骨細(xì)胞后，檢測(cè)肥厚markers的表達(dá)。
　　5.軟骨細(xì)胞分為5組，分別用復(fù)元膠囊含藥血清、壯骨關(guān)節(jié)丸含藥血清、空白血清進(jìn)行干預(yù)，模型組細(xì)胞用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)后不加干預(yù)，陰性對(duì)照組則不進(jìn)行任何干預(yù)，各組檢測(cè)相應(yīng)肥厚markers的表達(dá)，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并得出研究結(jié)論。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組合染色顯示OA早期患者關(guān)節(jié)軟骨即有COLⅡ、DD

6、R2表達(dá)，軟骨細(xì)胞HE染色可見軟骨細(xì)胞增生、肥厚及凋亡現(xiàn)象，切片上可見軟骨細(xì)胞肥厚的典型改變?yōu)椤办o止層-增生層-肥厚層-軟骨下骨層”。
　　2.目的基因和原核克隆載體pGEM-T連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，攜帶目的基因的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中克隆，藍(lán)白斑篩選得到純化的重組子并和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)連接，構(gòu)建完成后成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的軟骨細(xì)胞經(jīng)膠原誘導(dǎo)后獲得肥厚軟骨細(xì)胞模型。
　　3.采用RT-PCR及WT檢測(cè)

7、軟骨細(xì)胞肥厚標(biāo)志物mRNA及蛋白表達(dá)，PCR及WT結(jié)果均顯示:轉(zhuǎn)染FD組＞模型組＞轉(zhuǎn)染DS組＞未經(jīng)膠原干預(yù)組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　4.SB203580、PD98059以及Dkk1和軟骨細(xì)胞孵育后，采用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞，提取mRNA及總蛋白進(jìn)行目標(biāo)基因及蛋白表達(dá)測(cè)定，結(jié)果顯示MEK通路抑制劑PD98059對(duì)軟骨細(xì)胞肥厚markers表達(dá)無明顯作用，p38通路抑制劑SB203580和Wnt信號(hào)通路抑制劑Dkk1

8、均對(duì)軟骨細(xì)胞肥厚markers表達(dá)有不同程度影響，其中Dkk1對(duì)細(xì)胞表達(dá)肥厚markers有顯著影響，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理，結(jié)果顯示差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　5.復(fù)元膠囊及壯骨關(guān)節(jié)丸給藥后獲取大鼠含藥血清，軟骨細(xì)胞經(jīng)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)后與之共同孵育，檢測(cè)細(xì)胞肥厚相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示復(fù)元膠囊大中劑量組均對(duì)目標(biāo)蛋白表達(dá)有明顯的抑制作用，且大中劑量組之間無顯著性差異，復(fù)元膠囊小劑量組對(duì)目標(biāo)蛋白表達(dá)無明顯抑制作用。差別具有統(tǒng)計(jì)