透骨消痛膠囊含藥血清對軟骨細胞周期與凋亡影響的研究.pdf

1、目的：
　　 探討透骨消痛膠囊含藥血清影響軟骨細胞周期與凋亡的作用機制。
　　 方法：
　　 1.新西蘭大白兔60只,抽簽法隨機分為空白組(0.9％生理鹽水灌胃)、對照組(壯骨關節(jié)丸5mg/ml溶液灌胃)、實驗1組(透骨消痛膠囊2.5mg/ml溶液灌胃)、實驗2組(透骨消痛膠囊5mg/ml溶液灌胃)、實驗3組(透骨消痛膠囊10mg/ml溶液灌胃),20ml/次,2次/天,連續(xù)3天,腹主動脈采血,制備含藥血清。

2、r>　　 2.新西蘭大白兔32只,取膝關節(jié)軟骨建立體外培養(yǎng)的軟骨細胞,甲苯胺藍染色、RT-PCR檢測CollageⅡ mRNA鑒定。第3代軟骨細胞同步化,抽簽法隨機分為空白組、對照組、實驗1組、實驗2組、實驗3組,分別加入含15％各組血清DMEM培養(yǎng)24h、48h、72h,MTT檢測軟骨細胞的活性,流式細胞儀檢測軟骨細胞周期的分布,確定含藥血清的有效干預時間。第3代軟骨細胞同步化,抽簽法隨機分組分別加入含15％各組血清DMEM培養(yǎng)72

3、h,熒光倒置相差顯微鏡、光學顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察軟骨細胞的形態(tài)結構,RT-PCR檢測軟骨細胞CyclinD1、CDK4、p21 mRNA表達。
　　 3.第3代軟骨細胞培養(yǎng)72h,抽簽法隨機分為凋亡1組(SNP終濃度0mmol/L)、凋亡2組(SNP終濃度0.5mmol/L)、凋亡3組(SNP終濃度1mmol/L)、凋亡4組(SNP終濃度2mmol/L)干預24h,熒光倒置相差顯微鏡觀察軟骨細胞的形態(tài)結構,Hocehst3

4、3342染色鑒定軟骨細胞的凋亡,MTT檢測軟骨細胞的活性,確定SNP誘導軟骨細胞凋亡的量效關系。
　　 4.第3代軟骨細胞培養(yǎng)72h,抽簽法隨機分為空白組、對照組、實驗1組、實驗2組、實驗3組,分別加入含SNP終濃度為1mmol/L15％各組血清DMEM培養(yǎng)12h、24h、36h,MITT檢測軟骨細胞的活性,確定含藥血清的有效干預時間。第3代軟骨細胞培養(yǎng)72h,抽簽法隨機分組分別加入含SNP終濃度為1mmol/L15％各組血清D

5、MEM培養(yǎng)24h,MTT檢測軟骨細胞的活性,Hocehst33342染色檢測軟骨細胞的凋亡率,熒光倒置相差顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察軟骨細胞的形態(tài)結構,Annexin V-FITC/PI檢測軟骨細胞的早期凋亡,RT-PCR檢測軟骨細胞p53、Bcl-2 mRNA表達,比色法檢測軟骨細胞Caspase-3、Caspase-9蛋白活性。
　　 結果：
　　 1.原代、第2代、第3代軟骨細胞甲苯胺藍染色,胞漿內呈紫紅色異染顆粒

6、；原代、第2代、第3代、第4代、第5代軟骨細胞CollageⅡ mRNA表達逐漸降低,原代、第2代、第3代明顯高于第4代、第5代(P<0.01)。透骨消痛膠囊含藥血清促進軟骨細胞增殖的有效作用濃度為15％,有效作用時間為72h；干預72h,軟骨細胞的表型穩(wěn)定；軟骨細胞OD值,對照組、實驗2組、實驗3組明顯高于空白組(P<0.05)；軟骨細胞CyclinD1、CDK4 mRNA表達,對照組、實驗2組、實驗3組明顯高于空白組(P<0.05)

7、；軟骨細胞p21mRNA表達,對照組、實驗2組、實驗3組明顯低于空白組(P<0.05)。
　　 2.干預24h,SNP誘導軟骨細胞凋亡的有效作用濃度為1mmol/L。透骨消痛膠囊含藥血清抑制軟骨細胞凋亡的有效作用時間為24h；干預24h,軟骨細胞OD值,對照組、實驗2組、實驗3組明顯高于空白組(P<0.05)；軟骨細胞的凋亡率,對照組、實驗2組、實驗3組明顯低于空白組(P<0.05)；軟骨細胞p53 mRNA表達,對照組、實驗2

8、組、實驗3組明顯低于空白組(P<0.05)；軟骨細胞Bcl-2 mRNA表達,對照組、實驗2組、實驗3組明顯高于空白組(P<0.05)；軟骨細胞Caspase-3、Caspase-9蛋白活性,對照組、實驗2組、實驗3組明顯低于空白組(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.透骨消痛膠囊含藥血清能上調軟骨細胞周期正向調節(jié)因子CyclinD1、CDK4表達,下調負向調節(jié)因子p21表達,加速軟骨細胞周期關鍵限制點G1/S期的