紅花提取物對(duì)激素誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的干預(yù)作用.pdf

1、目的:激素性股骨頭缺血性壞死可能與激素誘導(dǎo)下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的成脂分化有關(guān),活血化瘀中藥對(duì)該病早期的防治有明顯療效。通過觀察中藥紅花活血化瘀有效成分羥基紅花黃色素A(HSYA)對(duì)激素性股骨頭缺血性壞死相關(guān)指標(biāo)的影響,研究HSYA對(duì)激素性股骨頭缺血性壞死的防治作用,由此進(jìn)一步驗(yàn)證活血化瘀中藥對(duì)激素性股骨頭壞死的防治效果,探討發(fā)病機(jī)制和中藥作用機(jī)理,為臨床提供更有效的治法和方藥的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:18只健康30天

2、齡sD大鼠,取其股骨內(nèi)髓腔組織,培養(yǎng)出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,傳代、純化、鑒定,以MTT法得出HSYA對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長的最佳濃度,以最佳細(xì)胞培養(yǎng)濃度為藥物中劑量組,2倍HSYA最佳濃度計(jì)量為高劑量組,1/2最佳濃度為中劑量組?？瞻捉M為以含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);對(duì)照組以含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基99ml+地塞米松儲(chǔ)存液1ml的培養(yǎng)液干預(yù);高劑量組含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基99ml+地塞米松儲(chǔ)存液1ml+20mgH

3、SYA培養(yǎng)液干預(yù);中劑量組以含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基99ml+地塞米松儲(chǔ)存液1ml+10mgHSYA培養(yǎng)液干預(yù);低劑量組以含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基99ml+地塞米松儲(chǔ)存液1ml+5mgHSYA培養(yǎng)液干預(yù)。上述5組培養(yǎng)6天后,行透射電鏡、油紅0染色、甘油三酯檢測(cè)、PCR法檢測(cè)PPARγmRNA和aP2mRNA的表達(dá)等檢測(cè)。
　　 結(jié)果:①細(xì)胞鑒定:形態(tài)學(xué)方面:光鏡下觀察大鼠BMSCs,細(xì)胞呈現(xiàn)出成纖維狀或紡錘狀,貼

4、壁生長,細(xì)胞相互緊密貼附生長,逐漸融合成片,沿胞體長軸有序排列,呈旋渦狀。BMSC經(jīng)傳代純化,三代BMSCs形態(tài)單一均勻,融合后呈典型的極性,漩渦狀生長;以流式細(xì)胞儀進(jìn)行標(biāo)志抗原CD45和CD90陽性表達(dá)率檢測(cè)方面檢測(cè)結(jié)果示:生長良好的貼壁細(xì)胞在第3代時(shí)行表面標(biāo)記物檢測(cè)。第3代細(xì)胞CD45陽性率約2.0％,CD90陽性率達(dá)99.6％?？梢哉f明本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁法體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。②油紅0染色示:空白組未見被染色的脂肪細(xì)胞

5、;對(duì)照組染色的脂肪顆粒最明顯。高、中、低劑量組均見數(shù)量較少的染色后的脂肪滴,均較對(duì)照組少。③電鏡觀察:空白組、高、中、低劑量組未發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)未見脂肪顆粒,細(xì)胞形態(tài)基本正常,對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)見大量脂肪顆粒堆積。④甘油三酯檢測(cè):對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯含量較空白組明顯升高,而HSYA各組較對(duì)照組均有明顯下降,藥物三組之間無明顯差異。與對(duì)照組比較,HSYA低、中、高劑量組均較對(duì)照組明顯降低。⑤熒光定量PCR:各組成脂轉(zhuǎn)錄因子PPARγmRN

6、A和aP2mRNA的表達(dá),其中PPARγmRNA對(duì)照組明顯高于空白組,HSYA高、中低劑量組與對(duì)照組均有非常顯著性差異(P＜0.01),與空白組比較,HSYA高、中劑量組與空白組比較P＞0.05,無明顯差異,低劑量組與空白組比較P＜0.01,有高度顯著性差異。aP2mRNA對(duì)照組明顯高與空白組(P＜0.01),高中低劑量組分別與對(duì)照組比較P＜0.05,均有明顯差異;高、中劑量組與空白組比較P＜0.05,見明顯差異,低劑量組與空白組比較P

7、＞0.05,遂低劑量組與空白組無明顯差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.本實(shí)驗(yàn)體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志物等技術(shù)鑒定其屬于BMSCs,且具有較高的純度。
　　 2.大劑量激素誘導(dǎo)可促使BMSCs向成脂分化,使脂肪細(xì)胞增多。
　　 3.HSYA干預(yù)后,細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量、PPARγmRNA和aP2mRNA的表達(dá)較對(duì)照組都明顯降低,油紅0染色、電鏡等見脂肪細(xì)胞及顆粒明顯較單純激素干預(yù)的后所