兩種經(jīng)濟貝類和刺參微衛(wèi)星-著絲粒作圖及遺傳圖譜的整合.pdf

1、我國是海水養(yǎng)殖大國，海洋貝類的養(yǎng)殖在我國海水養(yǎng)殖業(yè)中占有非常重要的地位。櫛孔扇貝(Chlamys farreri)和皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)是具有較高經(jīng)濟價值的兩種重要海洋貝類。近幾年來，我們在國際合作和基金項目的支持下，對櫛孔扇貝和皺紋盤鮑等海洋貝類的雌核發(fā)育進行了系統(tǒng)研究，探明了雌核發(fā)育機理以及雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)的細胞學(xué)機制，確立了皺紋盤鮑和櫛孔扇貝雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)的有效程序，查清了雌核發(fā)育二倍體的

2、生長和存活特點。本研究以這兩種貝類為研究材料，開發(fā)了櫛孔扇貝和皺紋盤鮑的多重PCR擴增體系，用大量的微衛(wèi)星和AFLP等分子標(biāo)記研究了這兩種貝類雌核發(fā)育二倍體的遺傳學(xué)特性，查清了貝類雌核發(fā)育的近交程度，利用雌核發(fā)育二倍體家系和兩個微衛(wèi)星連鎖圖譜上的大部分標(biāo)記及新篩選標(biāo)記的半四分體分析，構(gòu)建了這兩種貝類較高密度微衛(wèi)星-著絲粒圖譜，并與遺傳圖譜進行整合，定位了個連鎖群中著絲粒的位置。此外，我們還分析了重要的海水養(yǎng)殖種類刺參的雌核發(fā)育二倍體遺傳

3、學(xué)特性，完成了刺參遺傳連鎖圖譜部分連鎖群著絲粒的定位。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.櫛孔扇貝微衛(wèi)星標(biāo)記多重PCR的開發(fā)
　　 通過單個微衛(wèi)星位點的PCR擴增，6％聚丙酰胺變性凝膠電泳檢測微衛(wèi)星的特異性擴增條帶，查清各個微衛(wèi)星位點的最佳PCR擴增條件。挑選引物序列間互不干擾、擴增片段長度不重疊、退火溫度接近的2-3個位點進行多元PCR組合的篩選。本實驗開發(fā)了4組櫛孔扇貝高多態(tài)性微衛(wèi)星多重PCR擴增體系，提高了基因分型效率。

4、利用CERVUS3.0軟件對12個櫛孔扇貝全同胞家系360個子代進行家系鑒定，驗證了這4組微衛(wèi)星多重PCR家系鑒定效率。結(jié)果表明，144個基因型數(shù)據(jù)中4.9％的微衛(wèi)星位點出現(xiàn)偏分離，無效等位基因出現(xiàn)的頻率為14.8％，平均多態(tài)信息含量為0.872。家系鑒定分析顯示，一組微衛(wèi)星多重PCR鑒定成功率為75％，兩組鑒定成功率達到100％。
　　 2.櫛孔扇貝雌核發(fā)育二倍體遺傳學(xué)特性研究
　　 通過紫外線照射精子并用細胞松弛素B

5、(CB)抑制減數(shù)分裂第二極體釋放誘導(dǎo)了3個櫛孔扇貝雌核發(fā)育二倍體家系，研究了27個微衛(wèi)星位點在3個雌核發(fā)育家系中的分離，進行了微衛(wèi)星-著絲點重組率分析，通過雜合后代的比例計算出重組率y的范圍是0.05到0.78，平均值為0.41，發(fā)現(xiàn)在櫛孔扇貝的某些染色體上存在交叉干涉現(xiàn)象。假設(shè)完全干涉的條件下，計算出微衛(wèi)星-著絲點距離范圍是3 cM-39 cM。估算出櫛孔扇貝雌核發(fā)育子一代的近交系數(shù)為0.59。在3個對照組家系中這27個位點全部符合孟

6、德爾遺傳規(guī)律，其中9個位點存在無效等位基因。而在3個雌核發(fā)育組中，在CF01，CF02，CF17和CFMSP009這4個位點發(fā)現(xiàn)兩類純合子的比例偏離1:1。分析的所有雌核發(fā)育后代都只有母本的等位基因，沒有發(fā)現(xiàn)父本特異等位基因，說明本實驗用的雌核發(fā)育子代100％為雌核發(fā)育個體。
　　 3.櫛孔扇貝微衛(wèi)星標(biāo)記-著絲粒作圖及與遺傳圖譜的整合
　　 著絲粒作圖是進一步完善連鎖圖譜，研究染色體的交叉以及查明減數(shù)分裂過程中交叉干涉情

7、況的重要工具。從已發(fā)表的櫛孔扇貝遺傳連鎖圖譜所有19個連鎖群中挑選了137個微衛(wèi)星標(biāo)記，利用對照組篩選出90個母本雜合的微衛(wèi)星標(biāo)記，研究了這90個微衛(wèi)星在3個雌核發(fā)育二倍體家系中的分離，每個家系60個雌核發(fā)育子代，通過半四分體分析，完成了19個連鎖群的微衛(wèi)星-著絲粒作圖及與遺傳圖譜的整合。對照組分析結(jié)果顯示，90個微衛(wèi)星位點全部符合孟德爾遺傳，而雌核發(fā)育組中有4.4％的標(biāo)記偏離兩類純合子1:1分離比。第二次分裂分離比y值范圍是0.033

8、至0.778，平均值是0.332，證實了櫛孔扇貝某些染色體中存在交叉干涉現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)在至少兩個家系有分離的42個標(biāo)記中有1個在不同家系間有差異，表明個別位點在不同家系間的基因-著絲粒重組率有所差異。著絲粒定位結(jié)果基本符合櫛孔扇貝染色體核型，但在連鎖圖譜和著絲粒圖譜中發(fā)現(xiàn)一些位點順序有所不同。本研究使櫛孔扇貝遺傳連鎖圖譜上的信息更加完善，可作為基因組研究富有信息的工具，并為將來扇貝著絲粒結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 4.皺紋盤鮑

9、微衛(wèi)星標(biāo)記多重PCR的開發(fā)
　　 通過對單個微衛(wèi)星位點的PCR擴增，6％聚丙酰胺變性凝膠電泳檢測微衛(wèi)星的特異性擴增條帶，查清了各個微衛(wèi)星位點的最佳PCR擴增條件。對篩選出的具有清晰擴增產(chǎn)物，特異性好的位點進行位點的組合擴增，通過優(yōu)化退火溫度、反應(yīng)體系、引物濃度等條件摸索出最佳擴增條件。根據(jù)不同微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物的條帶亮度，調(diào)整引物添加量，最終達到較一致的擴增效率。本實驗開發(fā)了4組皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai

10、)微衛(wèi)星多重PCR擴增體系，提高了基因分型效率。運用CERVUS3.0軟件對12個皺紋盤鮑全同胞家系的372個子代進行家系鑒定，驗證了這4組微衛(wèi)星多重PCR在家系鑒定中的效率，發(fā)現(xiàn)有4.9％的微衛(wèi)星出現(xiàn)偏分離，無效等位基因頻率為10.6％，平均多態(tài)信息含量為0.82。僅用1組微衛(wèi)星多重PCR模擬和家系鑒定的成功率分別為86％和90％，兩組則達到100％。結(jié)果表明，微衛(wèi)星多重PCR技術(shù)能準(zhǔn)確地把任意子代鑒定到各個家系，可以滿足大批量家系材

11、料的分析，具有較好的應(yīng)用價值。
　　 5.皺紋盤鮑雌核發(fā)育二倍體遺傳學(xué)特性研究
　　 利用全基因組擴增技術(shù)，對皺紋盤鮑雌核發(fā)育二倍體面盤幼蟲的DNA進行了基因組擴增，分析了654個AFLP標(biāo)記的遺傳特性，比較了AFLP和微衛(wèi)星標(biāo)記在染色體上的分布情況。利用AFLP標(biāo)記在全基因組水平評價了雌核發(fā)育的近交效率以及交叉干涉的頻率和強度。所用654個AFLP標(biāo)記全部符合3:1孟德爾分離比，第二次分裂分離頻率y的范圍是0.00到0

12、.96，其中23.9％的y值大于0.67，證明皺紋盤鮑中存在交叉干涉現(xiàn)象。654個AFLP標(biāo)記平均重組率y為0.45，固定指數(shù)為0.55，說明減數(shù)分裂雌核發(fā)育是加快皺紋盤鮑基因純合程度的有效手段。在完全干涉條件下，AFLP標(biāo)記-著絲粒遺傳距離范圍是0.0-47.8 cM。AFLP標(biāo)記-著絲粒重組率y從0到1均勻分布，且沒有發(fā)現(xiàn)明顯的成簇分布。僅有少量標(biāo)記(4.4％)重組率y大于0.9，說明皺紋盤鮑的交叉干涉程度較低或為中等水平。本實驗首

13、次利用海洋貝類幼蟲的全基因組擴增技術(shù)實現(xiàn)了貝類幼蟲的AFLP標(biāo)記半四分體分析，研究結(jié)果為今后皺紋盤鮑的遺傳改良和選擇育種計劃提供了重要參考。
　　 6.皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記-著絲粒作圖及與遺傳圖譜的整合
　　 利用紫外線照射精子并用細胞松弛素B(CB)抑制第二極體排放構(gòu)建了2個皺紋盤鮑第二極體抑制型雌核發(fā)育二倍體家系，從皺紋盤鮑微衛(wèi)星連鎖圖譜上挑選了115個微衛(wèi)星位點進行引物合成，利用2個家系篩選出母本雜合的微衛(wèi)星位點97

14、個，僅用符合孟德爾分離規(guī)律的微衛(wèi)星標(biāo)記進行微衛(wèi)星-著絲粒作圖，通過半四分體分析，定位了18個連鎖群著絲粒的位置，實現(xiàn)了著絲粒圖譜與遺傳圖譜的完全整合，并發(fā)現(xiàn)了皺紋盤鮑中存在復(fù)雜的交叉現(xiàn)象。微衛(wèi)星一著絲粒重組率范圍是0.037至0.950，平均值是0.399，說明存在交叉干涉現(xiàn)象。計算出固定指數(shù)為0.6，是一代全同胞交配近交程度的2.4倍，說明雌核發(fā)育是加快皺紋盤鮑純合程度的有效方法。對照組分析結(jié)果顯示，97個微衛(wèi)星位點都符合孟德爾遺傳，

15、而雌核發(fā)育組中有5.2％的標(biāo)記偏離兩類純合子1:1分離比。發(fā)現(xiàn)了不同連鎖群交叉分布不一致現(xiàn)象。著絲粒位置大部分與核型一致，但在連鎖圖譜和著絲粒圖譜中發(fā)現(xiàn)個別位點的位置明顯不同。通過對LG2連鎖群上的4個位點的基因型進行同時檢測，進行了皺紋盤鮑染色體的交叉分布研究和連鎖分析。雌核發(fā)育A家系中共54個個體4個位點的基因型沒有缺失，共108條染色體，其中44個無交叉(40.7％)，23個單交叉(21.3％)，37個雙交叉(34.3％)和4個三

16、交叉(3.7％)。然而，對LG6上的4個位點的基因型進行同樣分析得到了較低的交叉重組率，其中111個無交叉(61.7％)，54個單交叉(30％)，12個雙交叉(6.7％)和3個三交叉(1.6％)。結(jié)果表明，皺紋盤鮑不同連鎖群的交叉頻率和交叉分布都有所不同，皺紋盤鮑中存在交叉干涉現(xiàn)象。實驗結(jié)果中微衛(wèi)星標(biāo)記與著絲粒之間相對距離的信息對遺傳連鎖圖譜著絲粒的整合有重要意義。
　　 7.刺參雌核發(fā)育二倍體人工誘導(dǎo)
　　 紫外線照射

17、使精子遺傳物質(zhì)失活，用細胞松弛素B(CB)處理受精卵抑制第二極體釋放，誘導(dǎo)刺參雌核發(fā)育二倍體。用強度為2561μw/(cm2·s)的紫外線(254 nm)照射不同時間的精子與正常卵子受精。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨照射時間的增加，卵裂率、早期胚胎存活率和小耳幼蟲發(fā)生率逐漸減低，照射30 s時小耳幼蟲發(fā)生率降為0。受精后35 min，顯微鏡下觀察到有20～30％受精卵排出第1極體時，用濃度0.5μg/ml的CB持續(xù)處理受精卵20 min，誘導(dǎo)出刺參第二極

18、體抑制型雌核發(fā)育二倍體，雌核發(fā)育二倍體發(fā)育速度低于正常二倍體。微衛(wèi)星分析表明，雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)率為93.3％。
　　 8.刺參雌核發(fā)育二倍體遺傳學(xué)特性研究
　　 通過紫外線照射使精子遺傳物質(zhì)失活，用細胞松弛素B(CB)處理受精卵抑制第二極體釋放，成功誘導(dǎo)出2個刺參雌核發(fā)育二倍體家系。選用了43個刺參微衛(wèi)星標(biāo)記，通過半四分體分析，利用2個刺參雌核發(fā)育二倍體家系進行了微衛(wèi)星-著絲粒作圖。對照組分析結(jié)果顯示，只有1個微衛(wèi)星位

19、點(2.3％)偏離孟德爾遺傳規(guī)律，而在雌核發(fā)育組中，有2個位點(AH058和AH130)偏離兩類純合子1:1分離比。微衛(wèi)星-著絲粒重組率范圍在0.00至0.80，平均值是0.21，固定指數(shù)為0.79。微衛(wèi)星分析結(jié)果表明，刺參中存在較弱的交叉干涉現(xiàn)象。固定指數(shù)0.79是一代全同胞交配近交程度(0.25)的3.2倍，說明減數(shù)分裂雌核發(fā)育可能是刺參快速建立純系的有效途徑。假設(shè)完全干涉的條件下，計算出微衛(wèi)星-著絲點之間的遺傳距離范圍是0-40

20、cM。通過半四分體分析，發(fā)現(xiàn)了2個與著絲粒緊密連鎖的標(biāo)記，分別是AH028和AH112。本研究定位了2個雄性連鎖群LG3和LG20中著絲粒的位置，實現(xiàn)了刺參遺傳連鎖圖譜部分連鎖群著絲粒位置的整合。
　　 綜上，本研究構(gòu)建了櫛孔扇貝和皺紋盤鮑中高密度微衛(wèi)星-著絲粒圖譜，并將微衛(wèi)星-著絲粒圖譜與微衛(wèi)星連鎖圖譜進行整合，確定了連鎖群中著絲粒位置。本研究進一步改善了現(xiàn)有遺傳連鎖圖譜，為今后開展與物理圖譜的整合奠定了重要基礎(chǔ)。通過雌核發(fā)育