人參皂苷Rg1對(duì)低氧-無(wú)血清培養(yǎng)誘導(dǎo)在鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的作用與機(jī)制研究.pdf

1、[目的]
　　 研究人參皂苷Rg1（ginsennoside Rg1）保護(hù)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat bonemarrow mesenchymal stem cells，rBMSCs)抵抗低氧-無(wú)血清處理誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及其相關(guān)機(jī)制。
　　 [方法]
　　 用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率，培養(yǎng)液中加入不同濃度的Rg1（0.1μg/l、0.5μg/l、1μg/l、5μg/l、10μg/l、50μg/l、100μg/l、5

2、00μg/l和1000μg/l）的方法篩選Rg1促細(xì)胞增殖的有效濃度。測(cè)定rBMSCs生長(zhǎng)7天的生長(zhǎng)曲線及Rg1的影響。無(wú)血清培養(yǎng)基置1％O2、5％CO2三氣培養(yǎng)箱中預(yù)平衡24h。rBMSCs更換低氧預(yù)平衡的無(wú)血清培養(yǎng)基后置1％O2、5％CO2三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，復(fù)制低氧/無(wú)血清培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。Annexin V-FITC/PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。羅丹明123和Hochest33258染色，熒光顯微鏡下觀察拍照

3、，檢測(cè)線粒體膜電位。比色法檢測(cè)Caspase-3活性。qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞HIF-1α、Bcl-2、Bcl-xl、Bad、Bax、Rho-A、ROCK-1、ROCK-2等目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)。Westemb1ot檢測(cè)HIF-1α、RhoA、ROCK-1、ROCK-2、MLC-2、Bcl-2、Bcl-xl、Bad、Bax等目標(biāo)蛋白的表達(dá)。si-RNA ROCK-1轉(zhuǎn)染rBMSCs，用RT-PCR和Western blot二種方法，從m

4、RNA和蛋白表達(dá)水平鑒定ROCK-1的敲除效率。
　　 [結(jié)果]
　　 1.人參皂苷Rg1抑制低氧-無(wú)血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的rBMSCs凋亡。
　　 10μg/l、50μg/l、100μg/l、500μg/l有明顯的促細(xì)胞增殖效應(yīng)。rBMSCs經(jīng)低氧-無(wú)血清培養(yǎng)24h后，低氧-無(wú)血清(C2)組的凋亡率為常氧對(duì)照組(C1)為3.24倍(P＜0.01);羅丹明123染色后黃綠色熒光增強(qiáng)，表示線粒體膜電位下降;Caspase-

5、3酶活性升高5.17倍;促凋亡基因Bad和Bax的mRNA表達(dá)分別增加1.16倍和0.5倍，P＜0.01和P＜0.05;蛋白表達(dá)分別增加1.98倍和1.6倍(均P＜0.05)。低氧-無(wú)血清+Rg1低、中、高（Rg1-L、M和H）濃度組相比C2組凋亡率均降低，線粒體膜電位升高，Caspase-3酶活性降低，Bad和Bax的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均降低(P＜0.05或P＜0.01);抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)在C1組、C2

6、組和Rg1-L組組間比較無(wú)明顯差異，而Rg1-M和H組Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)均升高(P＜0.05)。Bcl-xl mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.人參皂苷Rg1抑制ROCK-1 mRNA和蛋白表達(dá)以及ROCK-1基因敲除下調(diào)促凋亡基因的表達(dá)，上調(diào)抑凋亡基因的表達(dá)。
　　 同C1組相比較，C2組p-RhoA蛋白表達(dá)升高1.64倍(P＜0.05); ROCK-1的mRNA表達(dá)增加2.33倍，蛋

7、白表達(dá)增加了1.92倍(P＜0.05和P＜0.01);MLC-2蛋白表達(dá)增加1.71倍(P＜0.05)。Rg1各濃度組與C2組比較，pRhoA蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異;ROCK-1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯下降(P＜0.01); MLC蛋白表達(dá)下降(P＜0.05);ROCK-2的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 經(jīng)低氧-無(wú)血清處理的siROCK-1轉(zhuǎn)染組Bad mRNA表達(dá)較陰性轉(zhuǎn)染組降低73.2％(P＜0.01)，

8、蛋白表達(dá)降低53.5％(P＜0.01);Bax mRNA表達(dá)降低71.4％(P＜0.01)，蛋白表達(dá)降低47.2％(P＜0.05)。Rg1 siROCK-1各濃度組的反應(yīng)同單純si-ROCK-1轉(zhuǎn)染組。經(jīng)低氧-無(wú)血清處理的si-ROCK-1轉(zhuǎn)染組Bcl-2 mRNA表達(dá)較陰性轉(zhuǎn)染組升高2.62倍(P＜0.01)，蛋白表達(dá)升高2.11倍(P＜0.05); Rg1siROCK-1各濃度組的反應(yīng)同單純si-ROCK-1轉(zhuǎn)染組。Bcl-xl m