載脂蛋白A-I對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的人動(dòng)脈壁損傷的保護(hù)作用.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)采用膠原酶灌注消化法,從人臍動(dòng)脈中原代培養(yǎng)獲得人臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical artery endothelial cells,HUAEC),用含有牛腦垂體提取物等輔助添加物的培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)之后,獲得可用于實(shí)驗(yàn)的健康的內(nèi)皮細(xì)胞。采用組織塊貼塊法,從人臍動(dòng)脈中原代培養(yǎng)獲得人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(humanumbilical artery smooth muscle cells,HUASMC),進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)之后,獲得

2、可用于實(shí)驗(yàn)的健康的平滑肌細(xì)胞。用含有抗壞血酸(≥50μg/ml)的培養(yǎng)基孵育平滑肌細(xì)胞,使之合成并分泌膠原蛋白,形成內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)基質(zhì);然后將內(nèi)皮細(xì)胞以飽和密度接種到平滑肌細(xì)胞上,使內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞直接接觸并融合形成內(nèi)皮細(xì)胞-平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)(EC-SMC Coculture)模型。
　　 共培養(yǎng)模型采用免疫熒光染色法(immunofluorescent staining)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。分別對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的凝血因子-8相關(guān)抗原

3、(FactorⅧ related antigen)和平滑肌細(xì)胞的α-肌動(dòng)蛋白(α-Smooth Muscle Actin)進(jìn)行免疫熒光染色,然后針對(duì)共培養(yǎng)模型的同一視野分別拍攝內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的熒光照片,將照片疊加后即得到共培養(yǎng)模型的形態(tài)學(xué)特征。結(jié)果顯示,兩種細(xì)胞已成功融合,模擬出體內(nèi)動(dòng)脈壁的形態(tài)。
　　 共培養(yǎng)模型采用Dil-Ac-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)進(jìn)行功能學(xué)鑒定,用含Dil-Ac-LDL(5μg/ml)的培養(yǎng)基孵育共培養(yǎng)模型

4、2小時(shí),可觀察到細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào),證明共培養(yǎng)模型可行使人動(dòng)脈壁的功能。
　　 分別令共培養(yǎng)模型和單純內(nèi)皮細(xì)胞(EC monoculture or EC monolayer)進(jìn)行Dil-Ac-LDL吞噬反應(yīng),分別提取細(xì)胞內(nèi)液進(jìn)行熒光測(cè)定,結(jié)果顯示共培養(yǎng)模型Dil-Ac-LDL的內(nèi)吞量顯著高于單純內(nèi)皮細(xì)胞,證明共培養(yǎng)模型中內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞已建立聯(lián)系,使其具有更好的生理功能。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用改良的冷乙醇沉淀法,從血漿F-

5、Ⅳ組分中提取純化人血漿載脂蛋白A-I(Apolipoprotein A-I,ApoA-I),經(jīng)聚乙二醇濃縮后,用150 mmol/L磷酸緩沖液透析,得到可用于實(shí)驗(yàn)的純化的ApoA-I。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白免疫印跡法(westernblot)鑒定分離得到的蛋白為純化的ApoA-I(純度為98.4％,Mr為28kD)。對(duì)LPS激活

6、的巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒性抑制作用的實(shí)驗(yàn)顯示,制備得到的ApoA-I具有天然ApoA-I的生物活性。
　　 用超速離心法分離獲得人血漿低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL),經(jīng)生理鹽水透析、聚乙二醇濃縮后,使?jié)舛冗_(dá)到2-3mg/ml。加入CuSO4(終濃度為200μM)37℃氧化20小時(shí),經(jīng)生理鹽水透析除去銅離子后獲得可用于實(shí)驗(yàn)的Ox-LDL。用硫代巴比妥酸法測(cè)定制備Ox-LDL的氧化比值,用瓊脂糖電泳鑒

7、定制備Ox-LDL的遷移率。
　　 用Ox-LDL誘導(dǎo)人臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)趨化因子(chemokine),主要是單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)。實(shí)驗(yàn)按照陰性對(duì)照組、炎癥組100μg/ml Ox-LDL、治療組100μg/ml Ox-LDL+100μg/ml ApoA-I分組,在無(wú)血清、無(wú)輔助添加物條件下孵育內(nèi)皮細(xì)胞獲得條件培養(yǎng)基。用THP-1細(xì)胞進(jìn)行趨化實(shí)

8、驗(yàn)(chemotaxis experiment),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ApoA-I顯著降低Ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的趨化因子造成THP-1細(xì)胞的遷移率:陰性對(duì)照組(7.7±1.5％)、Ox-LDL炎癥組(69.0±3.5％)、Ox-LDL+ApoA-I治療組(40.3±7.1％),其中炎癥組和治療組比較,P＜0.05。
　　 在利用動(dòng)脈壁共培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行趨化效應(yīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)中,初步顯示ApoA-I具有抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞趨