還原型β2糖蛋白I抑制ox-LDL誘導巨噬細胞泡沫化和凋亡的研究.pdf

1、目的:
　　以動脈粥樣硬化(AS)為主要特征的糖尿病大血管并發(fā)癥，是糖尿病致殘、致死的最主要原因。目前動脈硬化發(fā)病機制尚未完全明了。AS的發(fā)生是一個多種因素在多層次上綜合作用的過程。血脂水平的升高伴隨著促炎因子的表達和免疫反應的激活，單核細胞活化成為巨噬細胞，血管壁脂質過氧化導致大量ox-LDL生成，巨噬細胞通過吞噬ox-LDL伴隨一系列信號分子的表達導致脂質代謝的障礙，并最終形成泡沫細胞。泡沫細胞的形成是AS早期變化的特征性標志

2、，巨噬泡沫細胞的形成及凋亡是動脈粥樣硬化斑塊損傷形成、發(fā)展和崩解的關鍵。因此探討影響巨噬泡沫細胞的形成和凋亡的影響因素作為AS治療的新策略日益受到重視。
　　本研究以小鼠RAW264.7巨噬細胞為研究對象，通過ox-LDL誘導構建巨噬細胞源泡沫細胞，探討還原型β2糖蛋白Ⅰ(R-β2GPⅠ)和β2GPⅠ對AS過程中泡沫細胞形成的影響，以及其可能機制。
　　方法:
　　1.構建RAW264.7巨噬細胞源性泡沫細胞模型，探討

3、OX-LDL誘導泡沫細胞的合適濃度。巨噬細胞在不同濃度的氧化型低密度脂蛋白溶液內孵育24h，高壓液相聯(lián)合質譜法(HPLC-MS)測定細胞內總膽固醇的含量，MTT法檢測細胞生長活力。
　　2.RAW264.7巨噬細胞培養(yǎng)并分四組:①對照組:不加干預因素;②泡沫細胞組:加入80mg/Lox-LDL;③β2GPⅠ組:加入80mg/Lox-LDL和100mg/Lβ2GPⅠ;④還原型β2GPⅠ組:加入80mg/Lox-LDL和100mg/L

4、還原型β2GPⅠ。共同孵育24h后，用油紅O染色觀察細胞形態(tài)，HPLC-MS法檢測細胞內膽固醇含量，流式細胞技術檢測細胞凋亡率研究還原型β2GPⅠ和還β2GPⅠ對巨噬細胞源性泡沫細胞脂質蓄積和細胞凋亡的影響。
　　3.應用實時定量PCR法研究還原型β2GPⅠ和β2GPⅠ對ox-LDL誘導的巨噬細胞源性泡沫細胞形成中 CD36、SR-B1、ABCA1、ABCG1等脂代謝相關受體mRNA表達的影響。
　　4.采用Western

5、Blot技術檢測還原型β2GPⅠ和β2GPⅠ對ox-LDL誘導的巨噬細胞源性泡沫細胞形成中p38MAPK、JNK/MAPK信號轉導通路及其下游促凋亡蛋白關鍵酶caspase9、caspase3表達的影響。
　　結果:
　　1.隨著ox-LDL濃度升高，巨噬細胞內的膽固醇含量逐漸增加。ox-LDL超過25mg/L時細胞活力逐漸下降。ox-LDL濃度在80mg/L時構建的泡沫細胞內總膽固醇含量適度，油紅0染色可見細胞內存在大量脂

6、滴，HPLC-MS檢測總膽固醇/膽固醇酯超過50％。細胞活力下降近50％。
　　2.細胞油紅O染色、細胞內膽固醇含量檢測顯示:β2GPⅠ組和還原型β2GPⅠ組巨噬細胞內膽固醇含量明顯低于泡沫細胞組(P＜0.05，P＜0.01)，還原型β2GPⅠ組膽固醇酯/總膽固醇(CE/TC)比值較β2GPⅠ組和泡沫細胞組均有降低(P＜0.05，P＜0.01)，且還原型β2GPⅠ組膽固醇含量及CE/TC比值較β2GPⅠ組更為減低（P＜0.05，

7、P＜0.01）。說明還原型β2GPⅠ能夠抑制氧化脂質誘導的泡沫細胞形成，其作用比β2GPⅠ組顯著。
　　3.流式細胞技術檢測細胞凋亡率結果顯示:泡沫細胞組細胞凋亡率對照組顯著增加（P＜0.01）;β2GPⅠ組和還原型β2GPⅠ組的細胞凋亡率較泡沫細胞組均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01;）;總細胞凋亡率較β2GPⅠ組明顯下降(P＜0.05)。
　　4.Real-time PCR顯示還原型β2GPⅠ和β2GPⅠ組較泡沫細胞

8、組巨噬細胞內CD36mRNA明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)。還原型β2GPⅠ組CD36mRNA較β2GPⅠ組下降更明顯（P＜0.05）。而且還原型β2GPⅠ較泡沫細胞組降低ABCA1mRNA表達(P＜0.05)。β2GPⅠ組ABCA1與泡沫細胞組無明顯差異。各組的ABCG1 mRNA、SR-B1mRNA水平無明顯差異。
　　5.Western blot檢測結果，ox-LDL能夠促進P38MAPK通路磷酸化并激活其下游促凋亡

9、的蛋白關鍵酶caspase9、caspase3表達，而還原型β2GPⅠ與泡沫細胞組相比可以明顯下調P38MAPK通路、JNK/MAPK通路的磷酸化水平并抑制caspase9、caspase3的表達（P＜0.05），從而起到對抗巨噬細胞凋亡的作用。與泡沫細胞組相比，β2GPⅠ可以下調JNK/MAPK通路，而對P38MAPK通路的作用沒有明顯差異。
　　結論:
　　1.以Ox-LDL誘導小鼠RAW264.7細胞成功構建巨噬細胞源

10、性泡沫細胞。方法簡單簡單，可重復性好，成模率高。為體外研究動脈硬化的機制及防治提供了良好的平臺。
　　2.還原型β2GPⅠ和β2GPⅠ能夠抑制ox-LDL誘導的泡沫細胞形成，還原型β2GPⅠ作用比β2GPⅠ更為顯著。
　　3.還原型β2GPⅠ和β2GPⅠ能夠抑制ox-LDL誘導的泡沫細胞凋亡，還原型β2GPⅠ作用比β2GPⅠ更為顯著。
　　4.還原型β2GPⅠ和β2GPⅠ能夠通過減少CD36mRNA水平來減少膽固醇的攝