基于MAPK與NOS信號Crosstalk調控的EOFAZ對ox-LDL誘導HAECs損傷保護作用實驗研究.pdf

1、目的：研究艷山姜揮發(fā)油（EOFAZ）對氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導損傷的人主動脈內皮細胞（HAECs）的保護作用及遷移和修復的影響，探索其保護作用是否與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）與一氧化氮合酶（NOS）信號相關聯(lián)，同時探索MAPK與NOS信號之間是否存在crosstalk調控，闡明EOFAZ保護作用機制，為血管內皮功能失調相關疾病的預防和治療提供實驗基礎和理論指導。
　　方法：
　?。?）EOFAZ保護作用研究分

2、為7組：正常對照組(control，無血清ECM)，模型組（ox-LDL，200mg/L ox-LDL），EOFAZ高劑量組（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ），EOFAZ低劑量組（200mg/L ox-LDL+10μg/L EOFAZ），阿司匹林組（Asp.，200mg/L ox-LDL+2.5×10-4mol/L Aspirin），卡維地洛組（Car.，200mg/L ox-LDL+1×10-6mol/L C

3、arvedilol），阿托伐他汀鈣組（Atov.，200mg/L ox-LDL+1×10-6mol/L Atorvastatin Calcium）。
　?。?）EOFAZ對細胞遷移與修復作用研究分為4組：正常對照組(control，0.5％ ECM)，模型組（ox-LDL，200mg/L ox-LDL+0.5% ECM），EOFAZ高劑量組（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ+0.5%ECM），EOFAZ低劑

4、量組（200mg/L ox-LDL+10μg/L EOFAZ+0.5%ECM）。
　?。?）MAPK信號研究分為5組：正常對照組(無血清ECM)，模型組（200mg/L ox-LDL），EOFAZ組（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ），MAPK抑制劑組（200 mg/L ox-LDL+40μmol/L SB203580或5μmol/L SP600125或10μmol/L PD98059），EOFAZ加MAP

5、K抑制劑組（200 mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ+40μmol/L SB203580或5μmol/L SP600125或10μmol/L PD98059）。
　?。?）NOS信號研究分為5組：對照組(無血清ECM)，模型組（200mg/L ox-LDL），EOFAZ組（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ），NOS抑制劑組（200mg/L ox-LDL+100μmol/L L-NAME或3

6、00μmol/L L-NMMA），EOFAZ加NOS抑制劑組（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ+100μmol/L L-NAME或300μmol/L L-NMMA）。
　?。?）MAPK抑制劑Crosstalk調控NOS信號研究實驗分為7組：對照組(無血清ECM)，模型組（200mg/L ox-LDL），EOFAZ組（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ），NOS抑制劑組（200mg/L

7、 ox-LDL+100μmol/L L-NAME或300μmol/L L-NMMA），p38MAPK抑制劑組（200mg/L ox-LDL+40μmol/L SB203580），JNK1/2/3抑制劑組（200mg/L ox-LDL+5μmol/L SP600125），ERK1/2抑制劑組（200mg/L ox-LDL+10μmol/L PD98059）。
　?。?）NOS抑制劑Crosstalk調控MAPK信號研究分為5組：對照

8、組(無血清ECM)，模型組（200mg/L ox-LDL），EOFAZ組（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ），MAPK抑制劑組（200mg/L ox-LDL+40μmol/L SB203580或5μmol/L SP600125或10μmol/L PD98059），NOS抑制劑組（200mg/L ox-LDL+100μmol/L L-NAME或300μmol/L L-NMMA）。體外培養(yǎng)HAECs，用ox-LDL復

9、制細胞損傷模型，加入EOFAZ、阿司匹林、卡維地洛、阿托伐他汀鈣、MAPK或NOS各抑制劑干預保護1h后，繼續(xù)加入ox-LDL繼續(xù)作用24h。采用MTT法分析細胞存活率，確定ox-LDL誘導細胞損傷的最佳濃度與時間。倒置顯微鏡觀察細胞損傷形態(tài)，吉姆薩(Giemsa)和蘇木精-伊紅（HE）染色觀察細胞損傷病理學特征。劃痕試驗（Wound scratch assay）進行細胞遷移距離與修復分析，微孔濾膜培養(yǎng)小室及雙室聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)(Trans

10、well)分析細胞遷移率。分別用酶標儀法、ELISA法分析細胞損傷的乳酸脫氫酶（LDH）和一氧化氮（NO）含量?；瘜W法檢測結構型一氧化氮合酶（eNOS）和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）含量。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，QRT-PCR）檢測p38MAPK、JNK1/2/3、ERK1/2、iNOS及eNOS mRNA表達水平。蛋白質免疫印跡分析

11、法（Western blot）檢測p38MAPK、p-p38MAPK、JNK1/2/3、p-JNK1/2/3、ERK1/2、p-ERK1/2、iNOS及eNOS蛋白表達水平。
　　結果：EOFAZ明顯提高HAECs損傷的細胞存活率，顯著改善細胞損傷病理形態(tài)，促進細胞損傷后的遷移和修復，明顯提高細胞損傷遷移率，同時能促進NO及eNOS的產生，抑制LDH及iNOS的釋放。QRT-PCR分析表明，EOFAZ以及相關抑制劑顯著下調iNOS

12、 mRNA表達水平，上調eNOS mRNA表達水平(P<0.05)，而對p38MAPK、JNK1/2/3、ERK1/2 mRNA表達無顯著影響，差異無統(tǒng)計學意義。Western blot結果表明，EOFAZ以及相關抑制劑顯著下調p-p38MAPK、p-JNK1/2/3、p-ERK1/2、和iNOS蛋白表達水平，上調eNOS蛋白表達水平(P<0.05)，但對p38MAPK、JNK1/2/3、ERK1/2總蛋白表達無顯著影響，差異無統(tǒng)計學意