基于MAPK與NOS信號Crosstalk調(diào)控的EOFAZ對ox-LDL誘導(dǎo)HAECs損傷保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究艷山姜揮發(fā)油（EOFAZ）對氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)損傷的人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAECs）的保護(hù)作用及遷移和修復(fù)的影響，探索其保護(hù)作用是否與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）與一氧化氮合酶（NOS）信號相關(guān)聯(lián)，同時探索MAPK與NOS信號之間是否存在crosstalk調(diào)控，闡明EOFAZ保護(hù)作用機(jī)制，為血管內(nèi)皮功能失調(diào)相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。
　　方法：
　?。?）EOFAZ保護(hù)作用研究分

2、為7組：正常對照組(control，無血清ECM)，模型組（ox-LDL，200mg/L ox-LDL），EOFAZ高劑量組（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ），EOFAZ低劑量組（200mg/L ox-LDL+10μg/L EOFAZ），阿司匹林組（Asp.，200mg/L ox-LDL+2.5×10-4mol/L Aspirin），卡維地洛組（Car.，200mg/L ox-LDL+1×10-6mol/L C

3、arvedilol），阿托伐他汀鈣組（Atov.，200mg/L ox-LDL+1×10-6mol/L Atorvastatin Calcium）。
　?。?）EOFAZ對細(xì)胞遷移與修復(fù)作用研究分為4組：正常對照組(control，0.5％ ECM)，模型組（ox-LDL，200mg/L ox-LDL+0.5% ECM），EOFAZ高劑量組（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ+0.5%ECM），EOFAZ低劑

4、量組（200mg/L ox-LDL+10μg/L EOFAZ+0.5%ECM）。
　?。?）MAPK信號研究分為5組：正常對照組(無血清ECM)，模型組（200mg/L ox-LDL），EOFAZ組（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ），MAPK抑制劑組（200 mg/L ox-LDL+40μmol/L SB203580或5μmol/L SP600125或10μmol/L PD98059），EOFAZ加MAP

5、K抑制劑組（200 mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ+40μmol/L SB203580或5μmol/L SP600125或10μmol/L PD98059）。
　　（4）NOS信號研究分為5組：對照組(無血清ECM)，模型組（200mg/L ox-LDL），EOFAZ組（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ），NOS抑制劑組（200mg/L ox-LDL+100μmol/L L-NAME或3

6、00μmol/L L-NMMA），EOFAZ加NOS抑制劑組（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ+100μmol/L L-NAME或300μmol/L L-NMMA）。
　?。?）MAPK抑制劑Crosstalk調(diào)控NOS信號研究實(shí)驗(yàn)分為7組：對照組(無血清ECM)，模型組（200mg/L ox-LDL），EOFAZ組（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ），NOS抑制劑組（200mg/L

7、 ox-LDL+100μmol/L L-NAME或300μmol/L L-NMMA），p38MAPK抑制劑組（200mg/L ox-LDL+40μmol/L SB203580），JNK1/2/3抑制劑組（200mg/L ox-LDL+5μmol/L SP600125），ERK1/2抑制劑組（200mg/L ox-LDL+10μmol/L PD98059）。
　?。?）NOS抑制劑Crosstalk調(diào)控MAPK信號研究分為5組：對照

8、組(無血清ECM)，模型組（200mg/L ox-LDL），EOFAZ組（200mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ），MAPK抑制劑組（200mg/L ox-LDL+40μmol/L SB203580或5μmol/L SP600125或10μmol/L PD98059），NOS抑制劑組（200mg/L ox-LDL+100μmol/L L-NAME或300μmol/L L-NMMA）。體外培養(yǎng)HAECs，用ox-LDL復(fù)

9、制細(xì)胞損傷模型，加入EOFAZ、阿司匹林、卡維地洛、阿托伐他汀鈣、MAPK或NOS各抑制劑干預(yù)保護(hù)1h后，繼續(xù)加入ox-LDL繼續(xù)作用24h。采用MTT法分析細(xì)胞存活率，確定ox-LDL誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的最佳濃度與時間。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞損傷形態(tài)，吉姆薩(Giemsa)和蘇木精-伊紅（HE）染色觀察細(xì)胞損傷病理學(xué)特征。劃痕試驗(yàn)（Wound scratch assay）進(jìn)行細(xì)胞遷移距離與修復(fù)分析，微孔濾膜培養(yǎng)小室及雙室聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)(Trans

10、well)分析細(xì)胞遷移率。分別用酶標(biāo)儀法、ELISA法分析細(xì)胞損傷的乳酸脫氫酶（LDH）和一氧化氮（NO）含量。化學(xué)法檢測結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（eNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）含量。實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，QRT-PCR）檢測p38MAPK、JNK1/2/3、ERK1/2、iNOS及eNOS mRNA表達(dá)水平。蛋白質(zhì)免疫印跡分析

11、法（Western blot）檢測p38MAPK、p-p38MAPK、JNK1/2/3、p-JNK1/2/3、ERK1/2、p-ERK1/2、iNOS及eNOS蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：EOFAZ明顯提高HAECs損傷的細(xì)胞存活率，顯著改善細(xì)胞損傷病理形態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞損傷后的遷移和修復(fù)，明顯提高細(xì)胞損傷遷移率，同時能促進(jìn)NO及eNOS的產(chǎn)生，抑制LDH及iNOS的釋放。QRT-PCR分析表明，EOFAZ以及相關(guān)抑制劑顯著下調(diào)iNOS

12、 mRNA表達(dá)水平，上調(diào)eNOS mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，而對p38MAPK、JNK1/2/3、ERK1/2 mRNA表達(dá)無顯著影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot結(jié)果表明，EOFAZ以及相關(guān)抑制劑顯著下調(diào)p-p38MAPK、p-JNK1/2/3、p-ERK1/2、和iNOS蛋白表達(dá)水平，上調(diào)eNOS蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，但對p38MAPK、JNK1/2/3、ERK1/2總蛋白表達(dá)無顯著影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意