中國結(jié)核菌耐多藥和廣泛耐藥相關(guān)基因突變特征及MAS-PCR研究.pdf

1、目的：
　　分析中國耐多藥（MDR-TB）和廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌（XDR-TB）耐藥相關(guān)基因的突變特征；建立與之相應(yīng)的等位基因特異性多重聚合酶鏈反應(yīng)（multiplex allele-specific PCR，MAS-PCR）技術(shù)，以實現(xiàn)對MDR-TB與XDR-TB的快速檢測，為MDR-TB與XDR-TB的診斷和監(jiān)測提供新的技術(shù)手段。
　　材料和方法：
　　1.采用比例法藥敏試驗，從全國23省收集的結(jié)核分枝桿菌菌株中篩

2、選了230株MDR-TB，27株XDR-TB及64株敏感菌株用于本研究。研究菌株由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病實驗室收集保藏并提供。
　　2.采用L-J培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，并通過CTAB（溴化十六烷基三甲銨）法提取全基因組DNA用于耐藥相關(guān)基因的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增，PCR產(chǎn)物采用脫氧核糖核酸（DNA）測序分析。
　　3.利用基因測序技術(shù)，分別對321株試驗菌株的katG基因，inhA調(diào)控區(qū)， ahpC－ox

3、yR基因間隔區(qū)，rpoB基因，gyrA, gyrB基因及rrs基因進(jìn)行序列分析。
　　4.根據(jù)我國MDR-TB及XDR-TB耐藥相關(guān)基因的突變特點，篩選與耐藥高度相關(guān)的基因突變位點，建立與之相應(yīng)的MAS-PCR檢測技術(shù)，對MDR-TB及XDR-TB進(jìn)行快速檢測。
　　5．利用MAS-PCR技術(shù)對湖南省200株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株（含MDR-TB， XDR-TB，敏感菌株）進(jìn)行檢測驗證，并與傳統(tǒng)比例法藥敏試驗結(jié)果進(jìn)行比較，評

4、價MAS-PCR技術(shù)的實用性。
　　結(jié)果：
　　1.257株耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌中，14.0％的菌株inhA基因發(fā)生突變，58.4%菌株的katG基因發(fā)生突變，16.7%菌株的oxyR-ahpC基因發(fā)生突變，同時考慮這三種基因，異煙肼耐藥相關(guān)基因突變檢出率可達(dá)79.8%；91.1%菌株的rpoB基因發(fā)生突變，67.1%菌株的gyrA基因發(fā)生突變，7.6%菌株的gyrB基因發(fā)生突變，40.0%菌株的rrs基因發(fā)生突變。

5、基因突變的主要位點為 katG315（49.8%），inhA-15（9.4%），rpoB531（49.8%），526（22.6%）和516（10.5%）， gyrA94（43.0%）和90（21.5%），rrs1401（40%）。
　　2.根據(jù)我國 MDR-TB及 XDR-TB耐藥相關(guān)基因的特點，建立了與之相應(yīng)的MAS-PCR耐藥檢測技術(shù)。對200株臨床分離株（43株MDR，其中4株XDR）進(jìn)行了MAS-PCR檢測。MAS-PCR

6、與比例法藥敏試驗比較，異煙肼耐藥檢測的敏感性為72.5%（50/69），對利福平檢測的敏感性為77.0%（40/52），檢測氧氟沙星敏感性為66.7%（14/21），而卡那霉素為75%（3/4），四種藥物檢測的特異性均為100%。
　　結(jié)論：
　　1.我國耐多藥結(jié)核菌異煙肼、利福平、氧氟沙星和卡那霉素耐藥相關(guān)基因最常見突變?yōu)閗atG315、inhA-15，rpoB531、526和516, gyrA94和90，rrs1401。