煙堿對(duì)AD大鼠認(rèn)知功能障礙的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、Alzheimer's病(AD)是神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶能力下降，智能減退，生活自理能力降低。由于社會(huì)老齡化，AD成為老年人繼心臟病、腫瘤和卒中之后的第四位死亡原因。AD患者智能下降，生活自理能力逐漸喪失，在治療和護(hù)理上耗費(fèi)大量的精力和費(fèi)用，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)壓力。 AD的特征性病理改變是老年斑(SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)、神經(jīng)元顆?？张葑冃浴⒛X血管淀粉樣變性等。由于AD的確切病因和發(fā)病機(jī)制并不完全清楚

2、，因而在臨床缺乏對(duì)AD明確有效的治療措施。近年來(lái)的研究表明，大腦局部過(guò)度的炎性反應(yīng)引起大量的細(xì)胞因子釋放，在AD的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。炎性反應(yīng)同老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)為AD的主要特征。針對(duì)AD的病理特點(diǎn)，我們認(rèn)為阻斷AD的炎性反應(yīng)是一治療靶點(diǎn)。 β-淀粉樣蛋白(Aβ)可激活小膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的分泌增加，小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-1β又刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步分泌炎性

3、細(xì)胞因子，加重Aβ的沉積，從而形成“惡性循環(huán)”，導(dǎo)致神經(jīng)元和突觸的不可逆損害，出現(xiàn)神經(jīng)病理和臨床改變。 人們開始用非甾體抗炎藥(NSAIDs)治療AD。研究表明，長(zhǎng)期應(yīng)用NSAIDs可以降低AD發(fā)病的危險(xiǎn)性并可緩解AD的癥狀。故抗炎治療可以延緩AD的發(fā)生，緩解AD的臨床癥狀。研究證實(shí)煙堿可抑制機(jī)體的炎性反應(yīng)。給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射煙堿，炎性反應(yīng)減輕。有學(xué)者經(jīng)過(guò)流行病學(xué)研究，提出吸煙可降低AD發(fā)病的危險(xiǎn)性。給AD患者使用煙堿透皮貼劑，認(rèn)知

4、功能得到改善。 煙堿在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的受體是膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元表面的α7nAChR，膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分泌炎性介質(zhì)的主要細(xì)胞。我們這項(xiàng)研究的目的是探討在AD大鼠內(nèi)，煙堿作用于膠質(zhì)細(xì)胞表面的α7nAChR對(duì)抗Aβ引起的炎性反應(yīng)，研究煙堿對(duì)AD大鼠認(rèn)知功能改善的作用機(jī)制。 我們給予AD模型大鼠口服煙堿，通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，并檢測(cè)α7nAChR、IL-1β、IL-6等的變化，觀察煙堿對(duì)AD大鼠認(rèn)知功能的改善作用，探討

5、煙堿的作用機(jī)制。在海馬神經(jīng)組織細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中加入煙堿和Ap25-35，檢測(cè)炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6變化，探討Aβ25-35對(duì)神經(jīng)元的損害作用，煙堿的抗炎效應(yīng)和對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。 主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果： 1.煙堿對(duì)AD大鼠海馬炎性反應(yīng)的作用 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分三組，煙堿AD組、AD對(duì)照組、正常對(duì)照組。給予S-D大鼠口服煙堿，然后在大鼠雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ25-35，建立煙堿AD大鼠模型。給S-D大鼠雙側(cè)海馬區(qū)注

6、射Aβ25-35，建立AD大鼠模型。 通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)煙堿AD組、AD組大鼠和正常對(duì)照組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化。煙堿AD組大鼠在平臺(tái)定位航行實(shí)驗(yàn)中潛伏期較正常對(duì)照組有所延長(zhǎng)，在平臺(tái)象限的游泳時(shí)間百分比和游泳距離百分比較正常對(duì)照組降低，但高于AD對(duì)照組，差異明顯。AD組大鼠平臺(tái)定位航行實(shí)驗(yàn)潛伏期雖有下降趨勢(shì)，但不穩(wěn)定，在平臺(tái)象限搜索次數(shù)較少，目的性不明確，與煙堿AD組、正常對(duì)照組相比差異明顯。對(duì)三組動(dòng)物進(jìn)行方差分析

7、，差異具有顯著意義。 對(duì)海馬組織α7nAChR蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)，AD組第1天、第7天、第15天α7nAChR蛋白明顯下降，與正常對(duì)照組相比，差異顯著。煙堿AD組第1天、第7天、第15天下降，但下降幅度不如AD組明顯，與AD組相比，存在差異；與正常組相比，無(wú)差異。 AD組海馬組織IL-1β、IL-6在1-15天明顯升高，第7天達(dá)峰值，第15天仍明顯高于正常對(duì)照組。煙堿AD組IL-1β、IL-6升高，但與AD組相比，升高幅度

8、不大，存在顯著性差異；與正常對(duì)照組相比，存在差異。 α7nAChR.免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞：α7nAChR免疫染色陽(yáng)性物質(zhì)位于細(xì)胞膜和細(xì)胞突起。正常對(duì)照組α7nAChR免疫陽(yáng)性物質(zhì)染色深，陽(yáng)性細(xì)胞排列規(guī)則、密集。煙堿AD組，α7nAChR免疫陽(yáng)性物質(zhì)染色較深，陽(yáng)性細(xì)胞排列比較有規(guī)則，接近正常對(duì)照組。AD組α7nAChR免疫染色略淺，陽(yáng)性細(xì)胞排列欠規(guī)則。 IB4免疫染色陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞：IB4免疫染色陽(yáng)性物質(zhì)位于整個(gè)細(xì)胞區(qū)域。正常

9、對(duì)照組海馬區(qū)IB4免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目少、染色淺，胞體扁長(zhǎng)，分支細(xì)、短；煙堿AD組：海馬區(qū)IB4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較正常組增多，染色淺，胞體形態(tài)與正常組類似；AD組：海馬區(qū)IB4免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，胞體增大，突起增長(zhǎng)增粗，部分IB4陽(yáng)性細(xì)胞呈灌木樣或桿狀。 GFAP免疫染色陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞：GFAP免疫染色陽(yáng)性物質(zhì)位于整個(gè)細(xì)胞區(qū)域。正常對(duì)照組海馬區(qū)GFAP免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目少，染色淡而均勻，胞體小，突起細(xì)短；煙堿AD組海馬區(qū)

10、GFAP免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多，染色加深，部分細(xì)胞胞體增大，突起增長(zhǎng)；AD組海馬區(qū)GFAP免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，胞體增大，突起增長(zhǎng)增粗。 IL-1β免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞：IL-1β免疫染色陽(yáng)性物質(zhì)主要位于細(xì)胞體。正常對(duì)照組、煙堿AD組大鼠海馬區(qū)IL-1β免疫染色陽(yáng)性物質(zhì)反應(yīng)弱，染色淺。AD組海馬區(qū)域IL-1β免疫染色陽(yáng)性增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞增多。 2、煙堿抗Aβ25-35神經(jīng)毒性作用研究 用2d齡Sprague-Da

11、wley大鼠海馬神經(jīng)組織細(xì)胞混合培養(yǎng)體系。實(shí)驗(yàn)分為：正常對(duì)照組、Aβ(2μM)組、煙堿(10μM)+Aβ(2μM)組、煙堿(20μM)+Aβ(2μM)組。 無(wú)菌分離海馬組織，培養(yǎng)海馬神經(jīng)組織細(xì)胞混合體系，到第5天，在相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞扁平，神經(jīng)元四周出現(xiàn)明顯光暈，胞體增大，突起長(zhǎng)出并逐漸伸長(zhǎng)，部分聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)。分別按10μM、20μM濃度加入煙堿，孵育1h后加入Ap(2μM)，再孵育24小時(shí)。檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液

12、IL-1β、IL-6含量，測(cè)定神經(jīng)元胞體直徑和突起長(zhǎng)度及細(xì)胞生存率。 煙堿Aβ組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6含量增高，煙堿濃度10uM時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6含量與正常對(duì)照組相比差異明顯，而煙堿濃度在20uM時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6含量與正常對(duì)照組相比差異不明顯。煙堿Aβ組兩種濃度下，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6含量與Aβ組相比，差異顯著。 神經(jīng)元熒光染色，正常對(duì)照組神經(jīng)元胞體

13、飽滿，細(xì)胞輪廓圓滑，神經(jīng)突起形成網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系；煙堿Aβ組，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)接近正常，神經(jīng)元胞體直徑和突起長(zhǎng)度與正常組相差不明顯；Aβ組，神經(jīng)元數(shù)目減少，部分細(xì)胞脫離底壁而漂浮，損傷神經(jīng)元逐漸退化、崩解，出現(xiàn)沉淀，神經(jīng)突起斷裂，神經(jīng)元胞體直徑增大，胞體腫脹，突起回縮。 煙堿(10μM)+Aβ(2μM)組、煙堿(20μM)+Ap(2μM)組細(xì)胞存活率分別為54.7％、62.27％。而Aβ組細(xì)胞存活率只有29.57％。煙堿具有抗Aβ神經(jīng)毒性

14、，提高細(xì)胞生存率，保護(hù)神經(jīng)元的作用。 結(jié)論: 大鼠口服煙堿后，在其雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ25-35，成功建立了煙堿AD大鼠模型。 在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，煙堿AD組大鼠平臺(tái)定位航行實(shí)驗(yàn)的潛伏期比正常對(duì)照組有延長(zhǎng)，但比AD大鼠明顯縮短；在空間探索實(shí)驗(yàn)中，煙堿AD組大鼠平臺(tái)象限游泳時(shí)間百分比、游泳距離百分比較AD組大鼠明顯增高。證實(shí)煙堿可改善AD大鼠認(rèn)知功能。 煙堿AD組與AD組比較，海馬小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)