半抗原誘導食物過敏發(fā)生機制及肥大細胞對Th2型過敏反應的調(diào)控作用.pdf

1、隨著社會工業(yè)化、環(huán)境的污染，化學物質(zhì)，特別是半抗原通過皮膚，呼吸道，消化道等途徑暴露機會的增多，過敏性疾病也呈明顯上升趨勢，食物過敏和相關疾病在全球范圍內(nèi)迅速增加，大約4％-8％的兒童和1％-2％的成年人對食物抗原具有IgE介導的高反應性。食物過敏(foodallergy)的癥狀輕則表現(xiàn)為輕度不適，重則表現(xiàn)為威脅生命的過敏性休克，已經(jīng)成為了對社會、經(jīng)濟巨大影響的疾病。最近幾年有關食物過敏領域的研究進展迅速，但其發(fā)病機制仍不清楚。

2、　　 半抗原(Hapten)是小分子量化學物質(zhì)(＜500Da)，自身不能引起免疫反應，但易于和蛋白或肽結合并影響或改變蛋白的免疫原性，從而引起機體對該種蛋白的致敏。研究顯示，半抗原引起的致敏占過敏性疾病發(fā)病的2％-15％左右，“半抗原-特應性過敏假說”（Hapten-AtopyHypothesis）提出通過消化道或皮膚接觸化學物質(zhì)，特別是半抗原暴露的增加，在過敏性疾病的發(fā)病機制中可能具有重要作用，并導致了過敏性疾病的明顯增加。然而，目

3、前為止，有關半抗原暴露導致的過敏性疾病其具體發(fā)病機制仍不十分清楚。近年來，隨著食物過敏的增加，通過食物加工、配方奶粉、抗生素和其他藥物等口服途徑接觸的半抗原成分也明顯增加。半抗原通過口服途徑暴露并與食物蛋白相結合是否能夠改變食物抗原的免疫原性，并成為食物過敏性疾病增加的環(huán)境誘導因素仍有待進一步研究。
　　 T細胞免疫球蛋白與黏蛋白域蛋白(TIM)-1表達于活化的輔助性T細胞，TIM4是TIM1的配體，活化的樹突狀細胞(dendr

4、iticcell，DC)表達TIM4。研究表明，TIM1與TIM4之間的相互作用在啟動抗原特異性的Th2反應方面起重要作用，例如當暴露于微生物產(chǎn)物葡萄球菌腸毒素(SEB)時能夠誘導DC表達TIM4。DC能夠被三硝基苯磺酸(TNBS)活化，然而，是否經(jīng)TNBS活化的DC也能夠表達TIM4仍不清楚。
　　 食物過敏是以腸道口服耐受受損和Th2(T-helper)極化為特征的免疫反應，同時產(chǎn)生食物過敏原特異性IgE抗體。Th2細胞分泌

5、IL-4、IL-5、IL-10和IL-13，能夠有效的激活B細胞產(chǎn)生IgE抗體，IgE與肥大細胞結合，并導致肥大細胞脫顆粒釋放絲氨酸蛋白酶、組胺、細胞因子等介質(zhì)，啟動針對特異性抗原的過敏反應。研究顯示，肥大細胞不僅是過敏反應中一種關鍵的效應細胞，而且能夠調(diào)控很多其它組織功能并參與調(diào)控固有免疫和特異性免疫及外周耐受的形成。肥大細胞已經(jīng)被看做像淋巴細胞和其它重要免疫細胞一樣，在機體防御及穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。絲氨酸蛋白酶是肥大細胞釋放介質(zhì)的一

6、種，研究顯示其具有很強的免疫調(diào)控功能。另外，一次接觸抗原后誘發(fā)的速發(fā)型免疫炎癥反應往往能夠自我平息，這種在急性過敏反應中起到自我限制和調(diào)控的具體因素仍未闡明。
　　 既然肥大細胞具有免疫調(diào)控功能，除了引起過敏炎癥反應，肥大細胞可能也在速發(fā)型過敏反應的調(diào)控和自限過程中發(fā)揮作用。絲氨酸蛋白酶能夠通過結合蛋白酶活化受體(protease-activatedreceptors，PAR)-1和PAR-2，從而進一步調(diào)控靶細胞。炎癥反應時，

7、肥大細胞和其他免疫細胞，如Th2細胞，在炎癥局部聚集，從而有機會發(fā)生相互作用。研究顯示，Th2細胞表達PAR-2和Bcl-6，是否肥大細胞來源的絲氨酸蛋白酶能夠通過激活PAR-2來調(diào)控Th2中Bcl-6的表達仍不清楚。人類B細胞淋巴瘤蛋白-6(Bcelllymphoma6protein,Bcl-6)由Bcl-6基因編碼，它是一種進化相對保守的鋅指結構轉(zhuǎn)錄因子，又被稱作Bcl-6轉(zhuǎn)錄阻遏因子，近來研究表明，Bcl-6在一類調(diào)節(jié)性T細胞中具

8、有重要的免疫調(diào)控功能，且能夠干擾IL-4基因的轉(zhuǎn)錄過程。來源于Th1和Th2細胞的不同細胞因子其表達量受基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，而Bcl-6將可能是影響Th2反應中的關鍵基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一。
　　 為維持免疫穩(wěn)態(tài)，機體存在一種調(diào)控和限制免疫反應的機制，除了活化誘導的細胞死亡（AICD）機制外，調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)在免疫反應的負向調(diào)控方面也具有重要作用。Tregs功能失常將導致過敏性疾病的發(fā)生，導致口服耐受受損和以Th2細胞為主

9、的過敏反應。IL-4和IL-13是Th2細胞分泌的主要細胞因子，在過敏性疾病，如過敏性哮喘、接觸性皮炎和食物過敏發(fā)生時，Th2型細胞因子會明顯增加。研究顯示，Tregs能夠調(diào)控Th2型免疫反應以免產(chǎn)生自身組織的損傷。然而，目前，啟動針對Th2型免疫反應調(diào)控的起始因素仍有待進一步研究。調(diào)節(jié)性T細胞分為兩種，自然狀態(tài)Tregs和可誘導Tregs，自然狀態(tài)Tregs在胸腺中產(chǎn)生，而可誘導Tregs則在外周組織中，當受到適當刺激時產(chǎn)生。CD4+

10、T細胞的可塑性最近幾年才被認識，通常CD4+T細胞并未達到分化末期，在一定的細胞因子環(huán)境下，保留著進一步分化為其他亞型CD4+T細胞的潛能。從輔助性T細胞中產(chǎn)生的各種細胞因子之間的相互影響及其平衡在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)方面起重要作用，然而其協(xié)調(diào)合作的內(nèi)在機制仍不明了。
　　 綜上所述，食物過敏發(fā)病機制仍未闡明，半抗原通過口服途徑暴露并與食物蛋白相結合可能能夠改變食物抗原的免疫原性，并成為食物過敏性疾病增加的環(huán)境誘導因素。肥大細胞不僅

11、在免疫炎癥反應中是一種關鍵的效應細胞，參與速發(fā)型過敏反應，而且，肥大細胞作為效應細胞和啟動因素在固有免疫中也起重要作用，是否肥大細胞來源的絲氨酸蛋白酶能夠通過激活PAR-2來調(diào)控Th2中Bcl-6的表達仍不清楚。本研究中，我們將首先通過細胞培養(yǎng)，探討半抗原TNBS對DC表型的影響，其次通過給予小鼠TNBS和OVA混合物，建立針對食物抗原的小鼠腸道Th2型過敏反應模型。通過本研究將初步探討食物過敏發(fā)病機制中新的環(huán)境誘導因素，并進一步評價模

12、型小鼠腸道中極化的Th2型過敏炎癥反應。然后以經(jīng)典的小鼠卵清蛋白(OVA)腸道Th2型過敏反應模型為研究基礎，采用肥大細胞缺陷小鼠，通過過繼轉(zhuǎn)移Th2細胞和骨髓來源肥大細胞來研究肥大細胞對腸道抗原特異性Th2型過敏反應的免疫調(diào)控功能。采用細胞學實驗進一步評價肥大細胞調(diào)控Th2細胞表達B細胞淋巴瘤蛋白-6(Bcelllymphoma6protein，Bcl-6)功能和Bcl-6介導Th2細胞轉(zhuǎn)變?yōu)檎{(diào)節(jié)性T細胞(regulatoryTcel

13、l，Treg)的功能。結果顯示，TNBS和食物抗原OVA一起能夠誘導小鼠腸道極化的Th2型過敏反應。和正常小鼠相比，過繼轉(zhuǎn)移Th2細胞能夠引起肥大細胞缺陷小鼠腸道強烈的Th2免疫反應，激活的肥大細胞能夠引起活化的Th2細胞中Bcl-6表達增加，增加的Bcl-6進一步誘導Th2細胞表達Foxp3(forkheadboxP3)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，而Th2型細胞因子表達則被抑制，從而使之轉(zhuǎn)變?yōu)門reg。而轉(zhuǎn)化而來的Treg具有抑

14、制其他Th2細胞活性的功能。本研究結果表明，半抗原可能是食物過敏發(fā)病中潛在的環(huán)境誘導因素之一，而激活的肥大細胞在抗原特異性Th2免疫反應自我限制和免疫調(diào)控中具有重要作用。
　　 方法：
　　 1、骨髓來源樹突狀細胞(BMDC)的產(chǎn)生及培養(yǎng)
　　 無菌操作臺中取小鼠股骨和脛骨，浸入75％乙醇中3-5min，PBS沖洗骨髓腔3次，將骨髓細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，離心收集細胞加入紅細胞裂解液于室溫靜置5min，離心后棄上

15、清，再加入RPMI1640培養(yǎng)基10mL重懸細胞。用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為2×105/ml，均勻后接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，48小時后全量換液，加入新鮮培養(yǎng)液及rmGM-CSF，rmIL-4繼續(xù)培養(yǎng)，每48h半量換液，并補足相應細胞因子。培養(yǎng)后的BMDC經(jīng)流式細胞儀(FACS)檢測純度。
　　 2、TNBS對BMDC特性的影響
　　 收集誘導產(chǎn)生的BMDC（純度＞90％），96孔板培養(yǎng)（2×105細胞/孔）24

16、小時，培養(yǎng)液中加入不同濃度的TNBS（0-200ng/孔）共培養(yǎng)3天，3天后離心收集細胞，ELISA分析TIM4、CD80及IL-12p70表達水平。
　　 3、小鼠腸道黏膜固有層單個核細胞(LPMCs)分離
　　 無菌取小鼠小腸組織放入預冷的PBS中沖洗3次，轉(zhuǎn)移小腸組織到另一個無菌培養(yǎng)皿中，PBS沖洗3次，將小腸組織剪成1cm長大小，轉(zhuǎn)移進15ml離心管，加入含0.15％DDT和1mMEDTA的PBS10ml，放入搖

17、床，37℃、65rpm搖20min。將腸組織剪成1mm大小碎片后放40μm濾網(wǎng)上，用注射器研磨并用PBS沖洗，用50ml離心管收集細胞。1500rpm離心10min去上清，用RPMI1640培養(yǎng)液洗細胞一次，離心后用Percoll分離細胞，收集40％和80％的Percoll之間的懸浮細胞層，加入5mlRPMI1640培養(yǎng)液，1000g離心5min收集細胞培養(yǎng)。
　　 4、免疫磁珠法(MACS)進行細胞分選
　　 密度梯度

18、離心去除死細胞，過濾網(wǎng)制備成單細胞懸液，進行細胞計數(shù)，300g×10min離心棄去上清液，重懸細胞，每107加90μl細胞分選緩沖液。每107個細胞總數(shù)加入經(jīng)特異性抗體包被的免疫磁珠10μl，混勻，冰上共孵育15min。加入預冷的緩沖液1.5ml，300g×10min離心收集細胞后重懸，每108個細胞加入500μl緩沖液。把MS型細胞分選柱放入MACS分選架，加入細胞懸液，待液體流干后，加入500μl緩沖液沖洗共3次，收集的細胞為免疫磁

19、珠非結合細胞部分。把分選柱轉(zhuǎn)移出磁場，加入500μl緩沖液后，迅速把與免疫磁珠結合的細胞推出，收集后的細胞為特異性抗體結合細胞。
　　 5、流式細胞儀檢測
　　 調(diào)整細胞濃度至1×106/ml，經(jīng)固定液冰上固定30min，離心收集細胞，加入1％的BSA冰上孵育30min。以1∶200的濃度加入一抗，混勻冰上孵育1h，PBS沖洗并離心后，收集細胞，以1∶200的濃度加入熒光標記的二抗，冰上孵育30min，PBS沖洗2次后1

20、500rpm離心5min收集細胞。每管中加入400μl的PBS重懸細胞，40μm濾網(wǎng)過濾以去除細胞團塊，進行流式細胞儀(FACSCanto，BDBioscience).分析。
　　 6、半抗原誘導小鼠腸道食物過敏模型的建立
　　 雄性BALB/c小鼠（6-8周），每組6只，在第0、1、2、3、4天灌胃給予小鼠含TNBS（1mg/鼠）和OVA（100μg/鼠）的PBS0.3ml，第9、11、13天再次給予OVA（1mg/鼠

21、）灌胃進行激發(fā)，最后一次灌胃24小時后處死小鼠，收集小鼠空腸組織用于下一步分析。
　　 7、腸道空腸組織中炎性細胞計數(shù)
　　 取各組小鼠空腸組織經(jīng)4％的多聚甲醛固定，制作石蠟切片，組織切片經(jīng)HE染色（單個核細胞和嗜酸性粒細胞計數(shù)）和Toluidineblue染色（肥大細胞計數(shù)）。顯微鏡下計數(shù)陽性細胞(200×)，每只小鼠腸道隨機取20個鏡下區(qū)域計數(shù)。
　　 8、腸道抗原特異性Th2反應評價
　　 分離的L

22、PMC（1×106/孔）經(jīng)CFSE染色標記，并和OVA共同培養(yǎng)4天，收集細胞FACS分析細胞增殖情況及進一步設門分析增殖細胞中CD3+IL-4+陽性細胞比率，收集培養(yǎng)上清液ELISA分析IL-4、IFN-γ表達量。
　　 9、ELISA進行蛋白表達量檢測
　　 收集細胞培養(yǎng)液或小鼠血清-80℃儲存待測。設標準孔8孔，每孔加入濃度分別為0pg/mL，31.2pg/mL，62.5pg/mL，125pg/mL，250pg/mL

23、,500pg/mL，1000pg/mL，2000pg/mL的標準品100μL，在其余待測孔中加入待測上清液樣本100μL，每個樣本設三個重復，用封板膜封上反應孔，37℃60min。用洗滌液充分洗板后，加入酶標試劑50μL，孔板置37℃30min，使用洗滌液充分洗板5次，甩掉洗滌液后倒置于濾紙上控干;每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，混勻4s后將孔板避光置37℃顯色15min。然后每孔加入50μl終止液，終止反應，15分

24、鐘內(nèi)在酶標儀450nm處讀出吸光度值，減去空白值即為所得吸光度值，根據(jù)標準曲線得到樣品中蛋白表達濃度。
　　 10、抗原特異性Th2細胞分離培養(yǎng)
　　 分離的OTⅡ小鼠脾臟細胞，經(jīng)免疫磁珠篩選去除其中CD8+T細胞，細胞(5×105/ml)在RPMI1640培養(yǎng)基中和卵清蛋白肽(OVA323-339)(1μg/ml)、IL-4(2ng/ml)、抗-IFN-γ抗體(5μg/ml)共培養(yǎng)4天。4天后，細胞加入IL-2(10n

25、g/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4天，培養(yǎng)第八天，經(jīng)MACS去除主要組織相容性復合體(MHC-Ⅱ+)陽性細胞，收集Th2細胞用于下一步實驗。
　　 11、骨髓來源肥大細胞的產(chǎn)生
　　 50％的RPMI1640中加入2mML-谷氨酸、0.1mM非必需氨基酸、抗生素和10％胎牛血清，和50％的WEHI-3細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基（作為IL-3的來源）混合制成培養(yǎng)基，培養(yǎng)雄性WBB6F1-Kit+/+(Kit+/+，inshort)小鼠骨髓細胞，共

26、10周。3周后，經(jīng)流式細胞儀檢測BMMC的產(chǎn)生比率。為進一步致敏肥大細胞，106細胞/mlBMMC培養(yǎng)液中加入抗-OVAIgE(500ng/ml)或抗DNPIgE（抗二硝基苯酚抗體），培養(yǎng)過夜。
　　 12、過繼轉(zhuǎn)移和Th2細胞的體內(nèi)激活
　　 雄性清潔級BALB/c小鼠，6～8周，分為兩組，每組6只，極化的Th2細胞(107細胞/鼠;經(jīng)CFSE標記)和BMMCs（2×106細胞/鼠）一起或Th2細胞單獨經(jīng)尾靜脈注入小鼠

27、體內(nèi)。小鼠隨后經(jīng)OVA(0.5mg/鼠)灌胃，每天一次，共3天。第4天處死小鼠，經(jīng)密度梯度離心法從小鼠小腸分離固有層單個核細胞(LPMCs)。
　　 13、實時定量PCR(qRT-PCR)
　　 收集培養(yǎng)細胞，計數(shù)1×107，1500rpm離心后收集細胞，酚氯仿法提取細胞總RNA，所提取的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外分光光度計計算濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩０凑辗崔D(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA第一鏈合成:在PCR反應E

28、p管中加入5倍Iscript反應緩沖液4μl，Iscript反轉(zhuǎn)錄酶1μl，超純水13.5μl，RNA模版1μg，調(diào)整總反應體系為20μl;反應條件為:25℃5min,42℃40min，85℃5min，反應產(chǎn)物放-20℃保存?zhèn)溆谩?5ngcDNA加入50μl1×SYBR-GreenIPCRmastermix中，上下游引物各200nM，進行PCR擴增35個循環(huán)。所有實驗重復三次，陰性對照采用未轉(zhuǎn)錄RNA作為模版或不加入模版作為對照。根據(jù)標

29、準曲線定量mRNA表達量，標準曲線采用擴增5μl從細胞中獲得的不同濃度稀釋的總RNA（1.0-0.025ng/μl采用二倍稀釋法）。未知標本中mRNA表達量通過標準曲線線性回歸方程計算得到，β-actin作為基因表達內(nèi)參照。
　　 14、RNA干擾（RNAi）
　　 構建的包含小鼠PAR2和Bcl-6的shRNA和對照shRNA慢病毒載體購自SantaCruz，并按照慢病毒載體操作說明轉(zhuǎn)染細胞。復蘇Lenti-X293T

30、細胞系，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，顯微鏡觀察細胞是否貼壁并生長良好。用Lenti-XHTX包裝系統(tǒng)進行病毒包裝，充分混勻XfectPolymer，每個轉(zhuǎn)染樣品需準備2個離心管，充分混勻每管試劑，把管2添加到管1中，迅速渦旋10s，在室溫下孵育DNA-Xfect混合物10min，把1200μl的DNA-Xfect溶液加入準備好的293T細胞中，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使其均勻，在37℃條件下培養(yǎng)過夜，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，病毒滴度在48

31、h后可達到最高，吸取慢病毒懸液，500g離心10min，取懸液用Lenti-XGoStix鑒定病毒產(chǎn)物;然后用病毒產(chǎn)物轉(zhuǎn)導靶細胞，轉(zhuǎn)導前12h，在10ml培養(yǎng)基中培養(yǎng)靶細胞至4×106個細胞，用細胞培養(yǎng)液稀釋病毒株，獲得所需要的MOI(0.5-5)，以得到最佳的轉(zhuǎn)導效率，在靶細胞中加入病毒懸液，轉(zhuǎn)導10h，移除丟棄存留病毒的轉(zhuǎn)導培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，收集細胞進行分析。經(jīng)westernblot檢測，基因抑制效率在轉(zhuǎn)

32、染后48小時達到90％，而對照組shRNA無基因抑制作用。
　　 15、共聚焦顯微鏡觀察
　　 取小鼠空場組織，去掉內(nèi)容物，PBS沖洗1次，加入OCT后迅速放入液氮中冰凍，冰凍組織切片后（4μm厚），室溫放置過夜，經(jīng)預冷的丙酮固定20分鐘，經(jīng)1％的小牛血清封閉30分鐘，加入一抗（0.5-1μg/ml）4℃孵育過夜。PBS沖洗組織3×5min，再加入熒光標記的二抗(0.5-1μg/ml)室溫孵育1小時，然后經(jīng)PBS沖洗3×

33、5min，封片共聚焦顯微鏡觀察。
　　 16、統(tǒng)計分析
　　 數(shù)據(jù)記錄為均數(shù)±標準差，所有實驗均重復三次，采用非配對雙側(cè)t檢驗或方差分析。Post-hoccomparisons經(jīng)Bonferroni'stest檢驗分析。p＜0.05作為顯著性水準。
　　 結果：
　　 1、半抗原TNBS可調(diào)控樹突狀細胞(DC)TIM4、CD80和IL-12的表達
　　 在BMDC中有少量的T1M4表達，當在BMD

34、C細胞培養(yǎng)液中加入TNBS后，TIM4表達呈一種劑量依賴性增長（TNBS濃度0-60ng/ml時），而當超過60ng/ml濃度時，加大培養(yǎng)液中TNBS濃度不能增加TIM4表達。BMDC中CD80表達量也隨培養(yǎng)液中TNBS濃度增加而增加。為進一步探討TNBS對DC的影響，取各組小鼠空腸組織分離腸道黏膜DC，westernblot分析DC中TIM4、CD80和IL-12的表達。結果顯示，和生理鹽水對照組相比，TNBS+OVA組小鼠腸道DC中

35、TIM4、CD80表達量明顯增高(p＜0.01)，而DC中IL-12的表達量明顯減少(p＜0.01)。
　　 2、經(jīng)TNBS和OVA共同刺激后小鼠血清中OVA特異性IgE及組胺明顯增加
　　 和只灌胃給予OVA或TNBS組相比，TNBS+OVA組小鼠血清中具有高水平的OVA特異性IgE(p＜0.05);TNBS+OVA組小鼠血清中組胺的水平和生理鹽水對照組相比明顯增加(p＜0.05)。
　　 3、小鼠腸道OVA抗

36、原特異性Th2細胞極化
　　 分離小鼠腸道黏膜LPMC經(jīng)CFSE標記后培養(yǎng)4天，培養(yǎng)液中加入特異性抗原OVA，F(xiàn)ACS結果顯示，和單獨給予OVA或TNBS灌胃組相比，TNBS+OVA組腸道LPMC中具有明顯的細胞增殖，增殖細胞部分經(jīng)設門分析顯示有93.9±12.2％的細胞為CD3+IL-4+T細胞。這一結果表明TNBS與OVA結合可誘導腸道Th2細胞極化。另外LPMC細胞培養(yǎng)液中Th1和Th2型細胞因子檢測，結果顯示，和對照組相

37、比，TNBS+OVA組小鼠LPMC細胞培養(yǎng)液中具有較高水平的IL-4，而IFN-γ水平較低(p＜0.05)。
　　 4、肥大細胞缺陷小鼠腸道中過繼轉(zhuǎn)移的Th2型炎癥反應與正常小鼠過繼轉(zhuǎn)移的Th2型炎癥相比更強烈
　　 經(jīng)過繼轉(zhuǎn)移OVA特異性Th2細胞并經(jīng)OVA激發(fā)組，肥大細胞缺陷W/Wv小鼠腸道中OVA特異性Th2增殖明顯增加(39.1％)，而在同時過繼轉(zhuǎn)移OVA特異性Th2細胞和經(jīng)OVA特異性IgE抗體致敏的骨髓來源肥

38、大細胞(BMMC)，并經(jīng)OVA激發(fā)組，肥大細胞缺陷W/Wv小鼠腸道中OVA特異性Th2增殖較少(8.30％)。另外一組肥大細胞正常組Kit+/+小鼠也被過繼轉(zhuǎn)移CFSE標記的OVA特異性Th2細胞，并經(jīng)OVA激發(fā)后，CFSE陽性Th2細胞增殖比率和只過繼轉(zhuǎn)移了OVA特異性Th2細胞的肥大細胞缺陷W/Wv小鼠組相近(39.7％)。CFSE陽性Th2細胞中IL-4mRNA表達量和Th2增殖比率呈正相關。
　　 5、激活的肥大細胞能夠

39、增加Th2細胞中Bcl-6的表達
　　 未經(jīng)刺激的Th2細胞中可檢測出低水平的Bcl-6的表達，而經(jīng)激活的肥大細胞刺激后，Th2細胞中Bcl-6表達量明顯增加，而在培養(yǎng)液中加入加入抗MMCP-6抗體能夠阻斷Th2細胞中Bcl-6的表達。把極化后的PAR2基因敲除Th2細胞和經(jīng)OVA特異性IgE致敏的肥大細胞按上述程序共培養(yǎng)，結果顯示Th2細胞中的Bcl-6表達量被明顯阻斷。如在培養(yǎng)體系中加入活性PAR2肽刺激Th2細胞，則Bcl

40、-6的表達量明顯增加。預先用p38MAPK或ERK1/2拮抗劑處理Th2細胞，結果顯示被激活的肥大細胞誘導的Th2細胞中Bcl-6的表達被明顯抑制，本結果表明PAR2相互作用增加Bcl-6的表達是通過MAPK途徑實現(xiàn)的。
　　 6、激活的肥大細胞能夠抑制活化的Th2細胞凋亡
　　 通過將抗原特異性的Th2細胞（經(jīng)CFSE標記）和經(jīng)OVA特異性IgE致敏的肥大細胞通過尾靜脈過繼轉(zhuǎn)移給W/Wv小鼠，并經(jīng)特異性抗原OVA激發(fā)。

41、實驗結果顯示，在未經(jīng)特異性抗原OVA激發(fā)組小鼠腸道中，有4.36％的CFSE陽性Th2細胞發(fā)生凋亡，而在過繼轉(zhuǎn)移了OVA特異性Th2細胞和OVA特異性IgE致敏的肥大細胞并經(jīng)特異性抗原OVA激發(fā)組小鼠腸道中，CFSE陽性Th2細胞發(fā)生凋亡比率為6.53％，和未激發(fā)組相比稍微增高。但在過繼轉(zhuǎn)移了OVA特異性Th2細胞和未經(jīng)特異性抗原OVA致敏的肥大細胞組小鼠腸道中，抗原特異性Th2細胞凋亡比率明顯增加。這一結果表明，抗原特異性的IgE致敏

42、的肥大細胞能夠抑制抗原特異性的Th2細胞凋亡。
　　 7、激活的肥大細胞能夠使極化的Th2細胞轉(zhuǎn)變?yōu)門regs
　　 在收集的CFSE陽性Th2細胞（過繼轉(zhuǎn)移的Th2細胞）中，只過繼轉(zhuǎn)移Th2細胞組，F(xiàn)oxp3陽性T細胞比率只有1.44％，而在過繼轉(zhuǎn)移了Th2細胞和特異性IgE致敏的肥大細胞組中，F(xiàn)oxp3陽性T細胞比率達到18.8％，但在過繼轉(zhuǎn)移了Th2和未致敏肥大細胞組，F(xiàn)oxp3陽性T細胞比率為1.13％。進一步分

43、析在過繼轉(zhuǎn)移了Th2細胞和特異性IgE致敏的肥大細胞組中，F(xiàn)oxp3陽性細胞表達高水平的TGF-β和少量的Th2型細胞因子。在過繼轉(zhuǎn)移了OVA特異性Th2細胞和OVA特異性IgE致敏的肥大細胞并經(jīng)特異性抗原OVA激發(fā)組小鼠組腸道中，可觀察到Foxp3和CFSE雙陽性細胞。這一結果表明，當暴露于激活的肥大細胞時，有一部分Th2效應性T細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榱薚regs。
　　 8、Bcl-6能夠抑制GATA3的表達從而促進Th2細胞中Foxp

44、3的表達
　　 在未與肥大細胞共培養(yǎng)組，細胞表達高水平的GATA3，而經(jīng)OVA特異性IgE抗體致敏的肥大細胞共培養(yǎng)后，細胞中GATA3表達被明顯抑制。在與OVA特異性IgE抗體未致敏的肥大細胞共培養(yǎng)組，和經(jīng)DNP-IgE致敏的肥大細胞共培養(yǎng)組中，細胞均表達高水平的GATA3。另外，Th2細胞中的Foxp3表達量與GATA3表達明顯呈負相關。而在Bcl-6阻斷的Th2細胞與致敏的肥大細胞共培養(yǎng)時，Th2表達低水平的Foxp3和高水

45、平的GATA3。本結果表明，激活的肥大細胞能夠上調(diào)Th2細胞中Bcl-6的表達，進一步抑制GATA3的表達，從而使Foxp3表達增加。
　　 9、誘導產(chǎn)生的Tregs具有免疫抑制功能
　　 我們從上述實驗中純化了CD4+CD25+TGF-β+Tregs和極化的Th2細胞（經(jīng)CFSE標記）。加入抗CD3和抗CD28抗體，常規(guī)培養(yǎng)兩種細胞3天，流式細胞儀分析。結果顯示，在未加入Tregs時，極化的CD4陽性T細胞明顯的增殖，

46、且細胞培養(yǎng)液中Th2型細胞因子表達量明顯增加，而在與Tregs共培養(yǎng)時，T細胞增殖及其Th2型細胞因子表達均被抑制。這一結果表明，轉(zhuǎn)變而來的Tregs具有免疫抑制功能。
　　 結論：
　　 1、食物過敏的發(fā)病機制仍不清楚。本研究首次揭示半抗原是食物過敏發(fā)病中潛在的環(huán)境誘導因素之一。
　　 2、本研究通過給予小鼠半抗原TNBS和食物抗原OVA建立了一個小鼠食物過敏模型。
　　 3、TNBS能夠誘導腸道黏膜D

47、C細胞表達TIM4，而后者和CD4+T細胞上的TIM1相互作用，從而誘導腸道極化的Th2反應。
　　 4、本研究國際上首次發(fā)現(xiàn)肥大細胞也具有免疫抑制功能并參與對急性過敏反應自我限制的調(diào)控。
　　 5、闡明了肥大細胞對Th2型過敏反應調(diào)控的分子機制，即激活的肥大細胞能夠誘導Th2細胞表達Bcl-6，表達的Bcl-6能夠抑制Th2細胞的增殖及細胞因子的表達，并使其進一步轉(zhuǎn)變?yōu)門reg細胞。
　　 6、研究首次發(fā)現(xiàn)了另