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文檔簡介
1、目的:
體外培養(yǎng)人多囊卵巢綜合征子宮內膜細胞,研究補腎調沖方對多囊卵巢綜合征患者子宮內膜的保護作用。
方法:
1.人子宮內膜細胞培養(yǎng):通過診刮獲取多囊卵巢綜合征患者的子宮內膜組織,采用膠原酶消化法,體外混合培養(yǎng)子宮內膜細胞,并對其進行傳代培養(yǎng);
2.細胞鑒定:經免疫熒光法鑒定子宮內膜間質細胞及腺上皮細胞特異性表面蛋白,以證實所獲得細胞為子宮內膜細胞,可進行后續(xù)研究;
3. MTT實驗:應
2、用 MTT比色法檢測子宮內膜細胞體外生長曲線,從而確定實施藥物干預的時間點;檢測補腎調沖方、孕酮、17β-雌二醇對子宮內膜細胞的生長抑制率,參考細胞生長抑制率IR≤10%所對應藥物濃度加藥干預;將子宮內膜細胞分為實驗組、陽性對照組、陰性對照組、空白對照組,其中實驗組、陽性對照組、陰性對照組分別予以補腎調沖方、孕酮及17β-雌二醇干預,空白對照組無干預措施;
4.透射電鏡觀察子宮內膜細胞超微結構:藥物干預后,分別收集各組子宮內膜
3、細胞,對其進行固定、切片,在透射電鏡下觀察各組細胞的超微結構;
5. ELISA法檢測子宮內膜細胞中孕激素受體的表達:藥物干預后,分別收集各組子宮內膜細胞,通過反復凍融使其釋放孕激素受體,應用雙抗體夾心ELISA法測定各組細胞中孕激素受體水平;
6.RT-PCR及Western blot檢測TGF-β1、Smad4 mRNA及蛋白的表達:藥物干預后,分別收集各組子宮內膜細胞,采用半定量RT-PCR檢測各組細胞中TGF
4、-β1、Smad4 mRNA的表達;通過Western blot法檢測各組細胞中TGF-β1、Smad4蛋白的表達。
結果:
1.體外成功培養(yǎng)出原代人子宮內膜細胞并對其進行傳代培養(yǎng);
2.經免疫熒光法鑒定子宮內膜間質細胞特異性表面蛋白 Vimentin表達陽性,腺上皮細胞特異性表面蛋白 CK-19表達陽性;
3.子宮內膜細胞體外培養(yǎng)第3天進入對數生長期,并持續(xù)至第5天,第6天進入平臺期,因此本實驗
5、選擇體外培養(yǎng)第3天對子宮內膜細胞實施藥物干預;對子宮內膜細胞實施藥物干預的濃度分別為:補腎調沖方2mg/mL,孕酮1×10-6M,17β-雌二醇5×10-7M;
4.經透射電鏡觀察發(fā)現,與雌激素組、空白對照組相比,實驗組、孕激素組細胞表面微絨毛數量多,有分支,甚至腫脹,線粒體體積增大,粗面內質網擴張,高爾基體腫脹;
5. ELISA法檢測子宮內膜細胞中孕激素受體水平發(fā)現,實驗組子宮內膜細胞中孕激素受體濃度低于空白對照
6、組、雌激素組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);實驗組孕激素受體表達與孕激素組相當,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);
6.經半定量RT-PCR及Western blot檢測發(fā)現,實驗組TGF-β1、Smad4 mRNA及蛋白表達高于雌激素組、空白對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);實驗組TGF-β1、Smad4 mRNA及蛋白表達與孕激素組相當,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
結論:
本課題以陰
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