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文檔簡(jiǎn)介
1、乙型肝炎已成為嚴(yán)重威脅人類健康的世界性疾病,也是當(dāng)前我國(guó)流行最廣泛、危害最嚴(yán)重的一種疾病。中國(guó)是世界上乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染的高發(fā)區(qū),目前全國(guó)約有1億人為HBV攜帶者。乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)是HBV感染后第一個(gè)出現(xiàn)的血清標(biāo)志物,已成為診斷HBV感染的重要指標(biāo)之一。
核酸適體(aptamer)是一類新型的特異識(shí)別分子,被視為人工抗
2、體。但與抗體相比,核酸適體穩(wěn)定性好、沒(méi)有免疫原性和毒性、能通過(guò)化學(xué)合成制備以及修飾、特異性強(qiáng)和親和性高。這些優(yōu)點(diǎn)使它有望取代和超過(guò)抗體,在生物醫(yī)學(xué)以及化學(xué)分析等領(lǐng)域起著重要的作用。SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)技術(shù)即指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù),利用該技術(shù)可從人工合成的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫(kù)中體外篩選出特異與靶物質(zhì)高度親和的核酸適體。化學(xué)發(fā)光法具
3、有靈敏度高、線性范圍寬、操作簡(jiǎn)單和易自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn),為疾病的分子檢測(cè)提供了一個(gè)良好的平臺(tái)。
基于磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles,MNPs)的磁分離具有分離速度快、效率高、操作簡(jiǎn)單、易實(shí)現(xiàn)功能化和自動(dòng)化、以及不影響分離物質(zhì)的活性等優(yōu)越的物理化學(xué)性質(zhì)和生物相容性。納米金可以作為生物分子的載體,能迅速、穩(wěn)定地與核酸和蛋白質(zhì)等生物分子結(jié)合,而幾乎不影響這些分子的生物活性。而且以納米金作探針載體,可以在納米金上
4、負(fù)載多個(gè)信號(hào)分子,從而對(duì)目標(biāo)靶分子的檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大。
本論文首先采用羧基化磁性納米顆粒為載體,SELEX篩選特異識(shí)別HBsAg的核酸適體,再將磁性納米顆粒、金納米顆粒、免疫分析、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)和核酸適體技術(shù)等進(jìn)行有機(jī)結(jié)合,建立了新的高靈敏、快速且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的HBsAg檢測(cè)方法,為HBV感染的早期、快速檢測(cè)診斷奠定基礎(chǔ)。具體內(nèi)容包括:
1.納米顆粒的制備、表面修飾與表征
Fe3O4磁性納米顆粒的制備采用軟模板法
5、制備,再采用經(jīng)典St(o)ber法并經(jīng)改進(jìn)后在Fe3O4顆粒表面包覆一層SiO2,形成Fe3O4@SiO2磁性納米顆粒。包硅后的Fe3O4@SiO2顆粒,需進(jìn)一步與蛋白質(zhì)、核酸適體和金納米顆粒等結(jié)合,因此再對(duì)其進(jìn)行氨基化、羧基化和巰基化等一系列表面化學(xué)修飾。金納米顆粒采用檸檬酸鈉還原法制備,并通過(guò)自組裝技術(shù)制備金磁復(fù)合顆粒。
所制備的Fe3O4顆粒呈圓形、大小比較均勻,粒徑為450 nm左右,分散性很好,但是表面比較粗糙;改進(jìn)
6、后的方法所制備的Fe3O4@SiO2顆粒,在Fe3O4的表面清晰可見(jiàn)包覆有一層硅,表面變光滑,而且分散性良好;Fe3O4@SiO2顆粒具有很強(qiáng)的磁響應(yīng)性,其磁飽和強(qiáng)度為43.86 emu/g;通過(guò)對(duì)Fe3O4顆粒、Fe3O4@SiO2顆粒、表面氨基修飾的Fe3O4@SiO2顆粒、以及表面羧基修飾的Fe3O4@SiO2顆粒分別進(jìn)行Zeta電位測(cè)定,表明對(duì)Fe3O4顆粒的包硅、以及包硅后的氨基修飾和羧基修飾均很成功,為Fe3O4@SiO2顆
7、粒作為載體進(jìn)一步與蛋白質(zhì)、核酸適體等物質(zhì)結(jié)合奠定了基礎(chǔ)。
所制備的金納米顆粒大小比較均勻,粒徑為15 nm左右,其Zeta電位為負(fù)值,峰值為-42.7 mv;巰基修飾的Fe3O4@SiO2顆粒與金納米顆粒通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合、自組裝為金磁復(fù)合顆粒,在SiO2表面吸附有許多金納米顆粒,但未形成明顯的核殼結(jié)構(gòu);Fe3O4@SiO2@Au復(fù)合顆粒磁性略微有所下降,但仍然具有良好的磁響應(yīng)性,其磁飽和強(qiáng)度為36.42 emu/g。
8、2.不對(duì)稱PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化
核酸適體SELEX篩選過(guò)程中,每一輪篩選均需使用單鏈寡核苷酸文庫(kù)與目標(biāo)靶分子進(jìn)行孵育,本論文采用不對(duì)稱PCR擴(kuò)增制備單鏈DNA文庫(kù),PCR反應(yīng)體系為50μL。對(duì)Taq DNA聚合酶用量、上下游引物的比例、退火溫度以及擴(kuò)增輪數(shù)等條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的不對(duì)稱PCR擴(kuò)增條件為:Taq DNA聚合酶用量1.5 U,上下游引物的比例90∶1,退火溫度68℃,擴(kuò)增循環(huán)數(shù)30。以不對(duì)稱擴(kuò)增的ssDNA產(chǎn)物經(jīng)
9、純化后作為下一輪篩選的文庫(kù)重復(fù)進(jìn)行篩選,直至篩選結(jié)束。
3.以羧基化磁性納米顆粒為載體的HBsAg核酸適體的篩選
首先采用EDC、NHS兩步法活化羧基化磁性納米顆粒(Fe3O4@SiO2顆粒),然后將篩選靶分子HBsAg與活化后的羧基化磁性納米顆粒進(jìn)行偶聯(lián),隨后與單鏈DNA文庫(kù)進(jìn)行孵育,再經(jīng)過(guò)分離、洗脫和PCR不對(duì)稱擴(kuò)增制備單鏈DNA文庫(kù)等過(guò)程篩選特異結(jié)合HBsAg的核酸適體。重復(fù)以上篩選過(guò)程,并對(duì)最后一輪篩選的產(chǎn)物
10、進(jìn)行克隆、測(cè)序以及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。經(jīng)過(guò)13輪篩選,隨機(jī)挑選15個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果獲得3個(gè)特異結(jié)合HBsAg的核酸適體,分別命名為H01、H02和H03,其中大部分序列為H01,表明特異結(jié)合HBsAg的高親和性核酸適體篩選成功。而且在這3個(gè)核酸適體中,H01的親和性最高,故選擇H01進(jìn)行下一步的HBsAg檢測(cè)應(yīng)用。
4.基于磁分離和免疫分析的化學(xué)發(fā)光核酸適體傳感器的構(gòu)建及檢測(cè)應(yīng)用
對(duì)篩選出的核酸適體H01進(jìn)行氨基修飾,
11、然后固定在羧基化MNPs表面,再捕獲待檢測(cè)樣本中的HBsAg,磁分離后再分別與抗HBsAg的鼠一抗、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)標(biāo)記的馬抗鼠二抗孵育,最后磁分離獲得所述的核酸適體傳感器,用于催化AMPPD化學(xué)發(fā)光體系。
用該核酸適體傳感器對(duì)純HBsAg蛋白和乙肝血清樣本進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明:在1-200 ng/mL范圍內(nèi),化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與HBsAg濃度具有良好的線性關(guān)系;通過(guò)利用正常血清、甲肝血清、
12、丙肝血清、以及甲、乙、丙肝混合血清作為對(duì)照,該核酸適體傳感器對(duì)乙肝血清中的HBsAg具有很高的特異性;并且,該傳感器對(duì)乙肝血清中的HBsAg的檢測(cè)限可達(dá)0.1 ng/mL,低于國(guó)產(chǎn)ELISA試劑盒的檢測(cè)限0.5 ng/mL。該核酸適體傳感器與ELISA試劑盒相比較,具有快速磁分離、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),因此在HBsAg的臨床檢測(cè)中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
5.基于雙功能化金納米顆粒的化學(xué)發(fā)光核酸適體傳感器的構(gòu)建及檢測(cè)應(yīng)用
13、上述構(gòu)建的基于磁分離和免疫分析的化學(xué)發(fā)光核酸適體傳感器不足之處在于磁性納米顆粒對(duì)化學(xué)發(fā)光具有遮蔽作用,為了克服這一缺點(diǎn),我們又構(gòu)建了基于雙功能化金納米顆粒的化學(xué)發(fā)光核酸適體傳感器。用該化學(xué)發(fā)光核酸適體傳感器對(duì)純HBsAg蛋白和乙肝血清樣本進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明:在1-225 ng/mL范圍內(nèi),化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與HBsAg濃度具有良好的線性關(guān)系;通過(guò)利用正常血清、甲肝血清、丙肝血清、以及甲、乙、丙肝混合血清作為對(duì)照,該核酸適體傳感器對(duì)乙肝血清中的
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