基于生物信息學(xué)途徑研究先天性膈疝肺發(fā)育不良的發(fā)生機(jī)制及干預(yù)藥物.pdf

1、先天性膈疝（Congenital diaphragmatic hernia，CDH）是由于先天性發(fā)育異常而導(dǎo)致膈肌缺損，腹腔臟器疝入胸腔，引起一系列病理生理變化，對心肺功能、全身狀況均造成不同程度的影響，是新生兒急危重癥之一，其發(fā)病率為1∶2000～5000。盡管近年來對CDH的認(rèn)識及治療水平有所提高，其病死率仍較高，達(dá)到40％～60％，其主要死亡原因是肺發(fā)育不良。然而，CDH肺發(fā)育不良的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，仍缺乏行之有效的治療手段，因此

2、，對該方面的研究已日益成為國際小兒外科領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　本課題主要采用生物芯片技術(shù)，運(yùn)用現(xiàn)行公認(rèn)的生物信息學(xué)方法，檢測Nitrofen誘導(dǎo)CDH胎肺發(fā)育不良中的差異表達(dá)基因及其相關(guān)miRNA表達(dá)模式，揭示了全轉(zhuǎn)錄組水平的編碼基因的表達(dá)變化，結(jié)合已知的基因功能和信號通路以及miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫，探討非編碼基因miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對編碼基因轉(zhuǎn)錄后的潛在調(diào)控關(guān)系和作用，多角度、全方面綜合地分析和歸納miRNA所調(diào)控的靶基因

3、的功能、信號通路及相關(guān)干預(yù)化合物，這將深化CDH肺發(fā)育不良發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，為預(yù)防肺發(fā)育不良的發(fā)生及探索新的產(chǎn)前干預(yù)方法提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　目的：
　　(1)利用國際上通用的CDH動(dòng)物模型(Nitrofen誘導(dǎo)CDH大鼠模型)，通過全基因組mRNA表達(dá)譜芯片檢測技術(shù)，研究肺發(fā)育不良mRNA表達(dá)譜變化;
　　(2)利用miRNA芯片的檢測，通過生物信息學(xué)技術(shù)分析差異表達(dá)miRNA與mRNA，研究CDH肺發(fā)育不良中

4、miRNA和mRNA表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及生物功能，為進(jìn)一步揭示CDH肺發(fā)育不良的機(jī)制提供更直接的科學(xué)線索。
　　(3)通過生物信息學(xué)藥物篩選工具Connectivity Map，研究CDH肺發(fā)育不良中基因與化合物分子功能的關(guān)系，為開發(fā)CDH肺發(fā)育不良的干預(yù)藥物提供更直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.Nitrofen誘導(dǎo)CDH大鼠模型構(gòu)建
　　取成年SPF級SD雌性大鼠12只，將其編號后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和C

5、DH組，另取6只雄性SD大鼠，將雄性和雌性SD大鼠按1∶2比例合籠過夜，于第二日上午在顯微鏡下觀察雌性大鼠陰道涂片，鏡下見到精子者視為妊娠，當(dāng)天上午則定為妊娠第0.5天。在孕第9.5天，CDH組大鼠經(jīng)胃管注入Nitrofen100 mg（溶于橄欖油，濃度100 mg/ml），對照組大鼠則灌入1ml橄欖油。在妊娠第21.5天，兩組分別在全身麻醉下行剖宮產(chǎn)術(shù)取出胎鼠，解剖胎鼠胸腔后取左肺組織。
　　2.mRNA表達(dá)譜芯片檢測
　

6、　采取Agilent4×44K大鼠全基因表達(dá)譜芯片檢測胎肺mRNA表達(dá)譜，分析差異化的mRNA;利用文獻(xiàn)挖掘工具FACTA及Pubmed數(shù)據(jù)庫對表達(dá)差異的mRNA進(jìn)行驗(yàn)證。
　　3.miRNA芯片檢測及差異miRNA-mRNA表達(dá)譜信息的聯(lián)合分析
　　利用miRNA芯片(Agilent Rat miRNA8×15K)檢測Nitrofen誘導(dǎo)CDH大鼠模型胎肺miRNA的表達(dá)情況，通過TargetScan預(yù)測差異表達(dá)miRNA

7、的靶基因，聯(lián)合差異表達(dá)mRNA進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology)分析和信號通路(Pathway)分析，并篩選出相關(guān)的miRNA及其靶基因。
　　4.已篩選miRNA及其靶基因的驗(yàn)證
　　應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miRNA及其靶基因在Nitrofen誘導(dǎo)CDH大鼠模型胎肺中的表達(dá)水平，免疫組化檢測靶基因在胎肺組織中的定位，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)明確miRNA及其靶基因的調(diào)節(jié)關(guān)系。
　　5.mRNA表達(dá)譜信息與co

8、nnectivity map藥物數(shù)據(jù)庫的整合分析
　　應(yīng)用生物信息學(xué)工具Connectivity Map，整合差異表達(dá)的mRNA信息，推測CDH肺發(fā)育不良中基因與藥物小分子功能的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　(1)Nitrofen誘導(dǎo)CDH大鼠模型
　　對照組的6只孕鼠經(jīng)剖宮產(chǎn)得到胎鼠71只。Nitrofen誘導(dǎo)CDH組6只孕鼠得到胎鼠59只，其中膈疝共38只，占64.4％(38/59);膈疝均為左側(cè)的后外側(cè)巨大膈疝（

9、膈肌缺損達(dá)50％以上），疝入胸腔的腹腔臟器主要有肝臟、胃、小腸和脾臟。解剖膈疝胎鼠胸腔后可見雙肺均縮小，與對照組相比，左肺明顯發(fā)育不良。HE染色從組織學(xué)上證實(shí)模型胎肺發(fā)育不良。
　　(2)mRNA表達(dá)譜
　　在所檢測的17，679個(gè)基因中，與對照組相比，CDH組共有10，121個(gè)mRNA表達(dá)上調(diào)、7，558個(gè)mRNA表達(dá)下調(diào)。利用Pubmed數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)挖掘工具FACTA進(jìn)行驗(yàn)證，共有63個(gè)相同的檢測基因，其中79.4％(5

10、0/63)與mRNA表達(dá)譜芯片檢測結(jié)果一致，表明mRNA芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。
　　(3)mRNA表達(dá)譜信息與其相應(yīng)miRNA的聯(lián)合分析
　　13個(gè)表達(dá)上調(diào)的miRNA共有3，126個(gè)表達(dá)下調(diào)的靶基因，共涉及716條信號通路，其中共同的信號通路是TGFβ信號通路、GnRHR信號通路;10個(gè)表達(dá)下調(diào)的miRNA共有2，729個(gè)表達(dá)上調(diào)的靶基因，共涉及564條信號通路，其中共同的信號通路是WNT信號通路、TGFβ信號通路、FGF信

11、號通路、GnRHR信號通路。選取TGFβ信號通路中TGF-β2基因及其相應(yīng)mir-141-3p、 WNT信號通路中FZD8基因及其相應(yīng)mir-375-3p進(jìn)行下一步的驗(yàn)證。
　　(4)TGFβ信號通路中TGF-β2基因及其相應(yīng)mir-141-3p在Nitrofen誘導(dǎo)CDH大鼠模型胎肺中的表達(dá)
　　CDH組與對照組胎肺中mir-141-3p的相對表達(dá)量分別為1.57±0.28、1.00±0.18，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p

12、＜0.05)。CDH組和對照組胎肺中TGF-β2 mRNA的相對表達(dá)量分別為0.58±0.17、1.00±0.15，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。免疫組化檢測顯示TGF-β2主要表達(dá)在氣道上皮細(xì)胞，CDH組中TGF-β2的表達(dá)水平明顯低于對照組（20.32±3.54、45.14±4.56，p＜0.05）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，mir-141-3p與TGFβ-2存在直接調(diào)控關(guān)系。
　　(5) WNT信號通路中FZD8基

13、因及其相應(yīng)mir-375-3p在Nitrofen誘導(dǎo)CDH大鼠模型胎肺中的表達(dá)
　　CDH組與對照組胎肺中mir-375-3p的相對表達(dá)量分別為0.41±0.15、1.00±0.17，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。CDH組和對照組胎肺中TGF-β2 mRNA的相對表達(dá)量分別為1.62±0.20、1.00±0.16，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。免疫組化檢測顯示FZD8主要表達(dá)在氣道上皮細(xì)胞，CDH組中FZD

14、8的表達(dá)水平明顯低于對照組（38.32±8.54、20.14±5.76，p＜0.05）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，mir-375-3p與FZD8存在直接調(diào)控關(guān)系。
　　(6) mRNA表達(dá)譜信息與connectivity map藥物數(shù)據(jù)庫的整合分析
　　通過connectivity map藥物數(shù)據(jù)庫分析，曲匹地爾、維甲酸、間羥異丙腎上腺素等藥物的負(fù)性富集分?jǐn)?shù)較高且P＜0.05，提示可較好地逆轉(zhuǎn)TGFβ信號通路相關(guān)基因;伊洛前列

15、素、腎上腺酮、硫馬唑等藥物的富集分?jǐn)?shù)較高且P＜0.05，提示可較好地逆轉(zhuǎn)WNT信號通路相關(guān)基因。
　　結(jié)論：
　　(1)利用高通量基因芯片檢測方法可篩選出Nitrofen誘導(dǎo)CDH大鼠模型胎肺發(fā)育不良的發(fā)展演變過程中差異表達(dá)基因譜，結(jié)果表明CDH肺發(fā)育不良的發(fā)生是一個(gè)涉及多基因的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程，其中TGFβ信號通路、WNT信號通路、FGF信號通路、GnRHR信號通路與其關(guān)系最為密切。
　　(2)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證明

16、mir-141-3p與TGF-β2者存在直接的調(diào)節(jié)關(guān)系;在CDH組中，mir-141-3p表達(dá)水平明顯上升，TGF-β2表達(dá)水平明顯下降，提示mir-141-3p及其靶基因TGF-β2參與了CDH肺發(fā)育不良的發(fā)生機(jī)制。
　　(3)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證明mir-375-3p與FZD8者存在直接的調(diào)節(jié)關(guān)系;在CDH組中，mir-375-3p表達(dá)水平明顯下降，F(xiàn)ZD8表達(dá)水平明顯上升，提示mir-375-3p及其靶基因Fzd8參與了CD