高糖培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞JAK-,2--STAT-,3-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的變化及對活性氧簇產(chǎn)生的影響.pdf

1、近年來，世界范圍內(nèi)糖尿病(DM)的發(fā)病率明顯上升。糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，長期高血糖狀態(tài)可導(dǎo)致腎臟組織損傷，功能障礙和衰竭。糖尿病腎病(DN)是DM患者致殘和死亡主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計我國DN年發(fā)生率高達(dá)30％，而據(jù)美國腎臟資料統(tǒng)計，約50％的終末期腎衰(ESRD)由糖尿病所致，并呈逐年上升趨勢。但目前研究尚未完全探明DN的發(fā)生發(fā)展機制，亦缺少有效的防治措施。因此，進(jìn)一步探討DN發(fā)病機制并且尋找阻止DN進(jìn)展的方法已成為國內(nèi)

2、外學(xué)者研究的熱點問題。 目前認(rèn)為糖尿病腎病的發(fā)病過程中有多種酶和轉(zhuǎn)錄因子被激活，涉及多條細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(DAG/PKC、MAPK、JAK/STAT)殺傷靶器官，即高糖可以通過激活多種細(xì)胞內(nèi)信號因子而導(dǎo)致靶器官損傷。其中 Janns 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(J=anns kinase / signal transducers and activators of transcription， JAK/STAT)信號傳導(dǎo)通路在

3、近年來越來越引起人們的重視，大量研究表明，其與系膜細(xì)胞的增殖，肥大及細(xì)胞外基質(zhì)分泌有關(guān)。但此信號通路與腎臟疾病的關(guān)系的報道尚不十分清楚目前的研究證實，氧化應(yīng)激在糖尿病的發(fā)病過程中為一原發(fā)且獨立的參與因素?；钚匝醮?ROS)在糖尿病腎病(DN)的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用，高糖可上調(diào)ROS，轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)在腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá)。ROS作為氧化應(yīng)激的中心環(huán)節(jié)，參與DN的病理生理過程。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NA

4、DPH)氧化酶通過其產(chǎn)生的ROS，可改變腎臟血流動力學(xué)，激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，導(dǎo)致糖尿病腎病(DN)的發(fā)生、發(fā)展。然而，在DN時ROS是否能夠通過調(diào)控JAK<,2>/STAT<,3>通路的活性而影響DN的病理生理過程，還有待于進(jìn)一步研究。為此我們設(shè)計了以下實驗： 目的： 1．觀察高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMC)P-STAT<,3>的表達(dá)變化，并利用JAK<,2>阻斷劑Ag-490阻斷JAK<,2>/STAT<,3>通

5、路，觀察其對P-STAT<,3>表達(dá)變化的影響，探討糖尿病狀態(tài)下GMC JAK<,2>/STAT<,3>途徑的活性變化。 2．觀察高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞在不同時間點下活性氧簇(ROS)產(chǎn)生的量的變化。 3．通過NADPH氧化酶抑制劑(Apocynin)阻斷ROS的產(chǎn)生，觀察高糖培養(yǎng)下系膜細(xì)胞P-STAT<,3>的表達(dá)變化，探討JAK<,2>/STAT<,3>通路與ROS之間的相互作用的影響。 方法：

6、1．細(xì)胞培養(yǎng)：購買的大鼠腎小球系膜細(xì)胞株，選用DMEM培養(yǎng)基，在025％胰蛋白酶+002％EDTA消化液消化并吹打均勻后，按1:3比例進(jìn)行傳代，3-5天傳代一次2．分組： (1)GMC伺步化后分成：正常糖濃度組(含糖5.5mmol/L)：高糖濃度(25mmol/L)；甘露醇組(5.5mmol/L糖+19.5mmol甘露醇)；正常糖+AG-490(濃度10umol/L)組；高糖+AG-490(濃度10umol/L)組。繼續(xù)觀察培養(yǎng)

7、24、48小時后用Western Blot及細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測系膜細(xì)胞STAT<,3>、P-STAT<,3>表達(dá)的變化。 (2)GMC同步化后分成：正常糖濃度組(N，含糖5.5mmol/L)：高糖濃度組(H，含糖25mmol/L)；甘露醇組(M，含5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇)；正常糖+Apocynin(N+A，Apocynin濃度為100umol/L)；高糖+Apocynin(H+A，Apocynin

8、濃度為100umol/L)，分別于0、12h及36h收集上清液，用比色法檢測系膜細(xì)胞產(chǎn)生ROS的量。 (3)NADPH氧化酶抑制劑Apocynin預(yù)處理，GMC同步化后分為正常糖濃度組(N，含糖5.5mmol/L)；高糖濃度組(H，含糖25mmol/L)；甘露醇組(M，含糖5.5mmol/L，甘露醇19.5 mmol/L)：正常糖+Apocynin(N+A，Apocynin濃度為100umol/L)組；高糖+Apocynin(H

9、+A，hpocynin濃度100umol/L)組；Apocynin提前1小時加入，與正常糖或高糖共同培養(yǎng)GMC48小時，培養(yǎng)結(jié)束后，用Western Blot方法檢測系膜細(xì)胞P-STAT<,3>表達(dá)。 3．檢測方法： (1)用細(xì)胞免疫化學(xué)方法定性檢測高糖環(huán)境下大鼠腎小球系膜細(xì)胞STAT<,3>、P-STAT<,3>表達(dá)的變化。 (2)用免疫印記法(Western Blot)半定量檢測高糖狀態(tài)下大鼠腎小球系膜細(xì)胞

10、STAT<,3>、P-STAT<,3>表達(dá)的變化。 (3)用比色法檢測高糖作用后培養(yǎng)系膜細(xì)胞上清液中ROS產(chǎn)生的水平。 結(jié)果： 1．高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞在24小時和48小時P-STAT<,3>的表達(dá)較正常糖濃度組明顯升高。甘露醇組與正常糖濃度組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而各組之間STAT<,3>表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。JAK<,2>阻斷劑Ag-490可抑制高糖下P-STAT<,3>的表達(dá)，但對STAT<,3>表達(dá)

11、無明顯影響。 2．高糖條件下，ROS產(chǎn)生明顯升高，NADPH氧化酶抑制劑Apocynin可明顯降低ROS的產(chǎn)生水平。 3．高糖條件下，Apocynin經(jīng)預(yù)處理后，在正常糖濃度和高糖濃度共同培養(yǎng)48小時，正常糖濃度組和正常糖+Apocynin組對比P-STAT<,3>的表達(dá)差異無明顯差別；高糖+Apocynin組較正常糖濃度組P-STAT<,3>明顯增加，但與高糖組相比P-STAT<,3>顯著降低。 結(jié)論：

12、 1．高糖通過磷酸化方式激活大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMC)JAK<,2>/STAT<,3>信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Ag-490可有效抑制GMC JAK<,2>/STAT<,3>信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的變化。 2．高糖作用下，腎小球系膜細(xì)胞ROS產(chǎn)生增加，并具有時間依賴性，NADPH氧化酶抑制劑Apoaynin可有效抑制ROS的產(chǎn)生。 3．高糖激活JAK<,2>/STAT<,3>通路后，阻斷ROS增加可部分抑制大鼠腎小球系膜細(xì)胞P-STAT