博萊霉素致肺纖維化小鼠肺組織中P65、α-SMA的表達(dá)及意義.pdf

1、肺間質(zhì)性肺疾病(ILD)是由200余種疾病組成的一類疾病，他們?cè)谂R床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室和病理學(xué)改變上具有一定共同特點(diǎn)，但又有各自不同的特征。肺纖維化的典型病理學(xué)過程為肺泡上皮損傷，炎性細(xì)胞聚集，成纖維細(xì)胞過度增殖，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，成纖維細(xì)胞增殖灶，以及蜂窩肺的形成。 博萊霉素可導(dǎo)致嚙齒類動(dòng)物急性肺損傷和肺纖維化，這一特點(diǎn)為研究肺間質(zhì)纖維化提供了成熟的動(dòng)物模型。核因子-k B(NF-kB)是重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)許多炎癥性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，

2、P65是其重要的功能亞單位。研究顯示，在BLM誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化病理過程中，NF-kB的表達(dá)明顯增強(qiáng)。成纖維細(xì)胞分化為表達(dá)α-平滑肌動(dòng)蛋白的肌成纖維細(xì)胞在肺間質(zhì)纖維化病理過程中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)以博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型為研究對(duì)象，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，旨在闡明NF-kB P65、α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的動(dòng)態(tài)變化，揭示NF-kB活化與α-SMA蛋白表達(dá)的相關(guān)性，研究NF-kB活化在成纖維細(xì)胞向肌成纖維

3、細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的作用，從而探討肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)理，為其治療提供新的治療靶點(diǎn)和理論實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法: 一、實(shí)驗(yàn)材料 8周齡雌性C57BL/6小鼠(體重17～20克)，無特殊病原體SPF級(jí)(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司)，寄養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物中心，博萊霉素A2(BLM-A2)15毫克/支(日本化藥株式會(huì)社，批號(hào)：H20040205)，小鼠抗人NF-kB P65單克隆抗體，小鼠抗人α-SMA單克

4、隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，即用型SP免疫組化試劑盒及DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。 二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立、分組與標(biāo)本處理 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立、分組 將60只C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均用10％水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，無菌手術(shù)暴露氣管進(jìn)行模型制作。實(shí)驗(yàn)組(BLM組)：50只，第0天向每只小鼠氣管內(nèi)分別注射20ul含BLM-A2(5m

5、g/kg)的無菌生理鹽水。對(duì)照組：10只，第0天氣管內(nèi)注入生理鹽水20ul。 2、標(biāo)本的采集與處理 在實(shí)驗(yàn)的第1、3、7、14、28天對(duì)實(shí)驗(yàn)組取材，每次隨機(jī)選取10只。第7、14天對(duì)對(duì)照組取材，每次隨機(jī)選取5只。以腹腔主動(dòng)脈放血法處死實(shí)驗(yàn)小鼠，留取肺組織。將左肺完整取出，放入4％多聚甲醛中固定3 h，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的組織切片。 三、肺組織常規(guī)病理分析 1、常規(guī)病理肺組織經(jīng)不同濃度酒精常規(guī)脫蠟至

6、水，行HE染色和Masson染色。 2、肺泡炎癥及纖維化程度的組織病理學(xué)評(píng)分方法依照Szapiel法確定肺泡炎癥及纖維化程度，兩者均分4級(jí)，分別記為1、2、3、4分。 四、實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo) 應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)(SP法)，檢測(cè)肺組織內(nèi)NF-κB P65、α-SMA蛋白的定位及表達(dá)。 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t

7、檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較采用單因素方差分析，單因素相關(guān)分析采用spearson相關(guān)分析法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 一、肺組織的病理變化 肺組織病理HE染色顯示，對(duì)照組未見明顯的炎癥細(xì)胞及大片實(shí)變改變。實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)氣管注射BLM后第3天，可見肺泡壁略增寬，肺泡腔和肺間質(zhì)內(nèi)有炎性細(xì)胞滲出；第7天，肺泡間隔增厚，局部肺泡萎陷，肺泡腔內(nèi)可見滲出改變，內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；第14、28天肺泡炎開始消退

8、，肺泡間隔明顯增厚，大量肺泡萎陷，結(jié)構(gòu)破壞，形成多發(fā)片狀實(shí)變，實(shí)變組織內(nèi)可見大量細(xì)胞浸潤(rùn)。 Masson三色染色提示，對(duì)照組肺組織含有少量膠原纖維，為ECM的主要組成部分。模型組小鼠早期(第7天)即出現(xiàn)膠原纖維沉積，后期隨時(shí)間推移，膠原纖維沉積逐漸增多，纖維化程度逐漸加重，28天時(shí)可見在大片實(shí)變組織內(nèi)出現(xiàn)大量的膠原沉積，形成典型的間質(zhì)纖維化改變。 二、肺泡炎癥及纖維化程度的病理學(xué)評(píng)分結(jié)果 1、肺泡炎癥程度病理學(xué)評(píng)

9、分 氣管注射博萊霉素后各時(shí)間點(diǎn)，肺泡炎癥評(píng)分與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第7天肺泡炎病理評(píng)分最高，為3.6±0.52。 2、肺纖維化程度評(píng)分 氣管注射博萊霉素后，第7天開始形成纖維化，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，肺組織纖維化的程度逐漸加重。28天后，肺纖維化病理評(píng)分為3.8±0.42，肺纖維化病理改變最明顯。 三、肺組織NF-κB P65和α-SMA的免疫組化染色結(jié)果 1、肺組織NF-κB P65免疫組化染色結(jié)

10、果 在實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中，可見巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、支氣管黏膜上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞P65免疫組化染色呈陽性，且可見多數(shù)胞核呈陽性表達(dá)。正常對(duì)照組小鼠肺組織上述細(xì)胞僅部分胞漿呈弱陽性染色，未見細(xì)胞核著色，且第7天與第14天比較無差異。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)的P65表達(dá)均較正常對(duì)照組明顯升高。氣管注射BLM后第1天，表達(dá)水平明顯高于3天、7天、14天和28天，第3天表達(dá)較第1天降低，并呈逐漸下降趨勢(shì)，但28天仍明顯高于對(duì)照組。

11、2、肺組織α-SMA免疫組化染色結(jié)果 在正常對(duì)照組小鼠肺組織中，α-SMA僅在較大血管、支氣管壁的平滑肌細(xì)胞的胞漿中呈明顯的陽性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組則除支氣管平滑肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞外，還可在肺間質(zhì)細(xì)胞的胞漿中見到表達(dá)。氣管注射BLM后，各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較，α-SMA蛋白的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，且隨時(shí)間的推移進(jìn)一步增高，14和28天表達(dá)最強(qiáng)。 四、NF-κB P65和α-SMA表達(dá)的相關(guān)性分析 氣管注射BLM后早期(0～3