基質(zhì)細胞衍生因子促進脂肪干細胞向創(chuàng)傷區(qū)域定向遷移的研究.pdf

1、目的：
　　本研究的目的在于探究SDF-1對于誘導ADSCs向創(chuàng)傷組織定向趨化遷移的作用，進一步驗證通過調(diào)控SDF-1的局部濃度控制ADSCs向創(chuàng)傷組織的趨化遷移是否可行，為充分動員ADSCs發(fā)揮促修復作用尋找新策略，對于干細胞療法的廣泛應用也具有重要的臨床指導意義。
　　方法：
　　1.采用改良的酶消化法分離獲得SD大鼠ADSCs，經(jīng)體外培養(yǎng)、傳代擴增細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學特征，通過流式細胞檢測細胞表面C

2、D29、CD34、CD45及CD90的表達，體外誘導細胞成脂成骨分化檢測其多向分化能力。
　　2.構(gòu)建攜帶eGFP基因的慢病毒載體，以經(jīng)驗感染復數(shù)MOI=40轉(zhuǎn)染第3代ADSCs，并且分別于轉(zhuǎn)染后的24h、48h、72h、96h時，于熒光顯微鏡下觀察ADSCs的綠色熒光蛋白的陽性表達情況，并于轉(zhuǎn)染一周后，使用流式細胞檢測ADSCs的eGFP陽性表達率。繼續(xù)傳代轉(zhuǎn)染后的細胞至第九代，于熒光顯微鏡下觀察，驗證隨著細胞的增殖傳代，eGF

3、P是否可以穩(wěn)定表達。用MTT法檢測Lentivirus-eGFP轉(zhuǎn)染后ADSCs的細胞活性。對eGFP-ADSCs進行成脂成骨誘導分化，以檢測轉(zhuǎn)染后的細胞是否仍具備多向分化能力，且驗證分化后的eGFP-ADSCs是否仍可表達綠色熒光蛋白（eGFP）。
　　3.利用含有SDF-1的基礎培養(yǎng)基對體外傳代至第3代的ADSCs進行培養(yǎng)2天后，流式細胞技術(shù)及蛋白質(zhì)印跡分析法檢測其細胞中SDF-1受體CXCR4及CXCR7的表達情況，并與正常

4、傳代培養(yǎng)的第3代ADSCs進行比較。
　　4.構(gòu)建Transwell細胞遷移模型，檢測體外SDF-1對ADSCs遷移的影響，并且設置SDF-1的濃度梯度為0ug/L、1ug/L、10ug/L、100ug/L，檢測1-100ug/L濃度范圍內(nèi)，.ADSCs的遷移與SDF-1,濃度有無相關(guān)性。
　　5.構(gòu)建大鼠背部創(chuàng)傷模型，通過動脈移植途徑向動物模型中注入eGFP-ADSCs，設置空白對照組(未做創(chuàng)傷處理，僅移植eGFP-ADS

5、Cs)、創(chuàng)傷組（大鼠背部創(chuàng)傷+eGFP-ADSCs移植）、SDF-1干預組（大鼠背部創(chuàng)傷+eGFP-ADSCs移植+局部SDF-1給藥）。定期取大鼠背部創(chuàng)傷組織，利用Elisa法檢測創(chuàng)傷組織中SDF-1在創(chuàng)面愈合過程中的表達趨勢;利用RT-PCR檢測創(chuàng)傷組織中eGFP基因的表達情況，并在共聚焦顯微鏡下觀察eGFP-ADSCs在創(chuàng)傷組織冰凍切片中的遷移分布情況。定期采集大鼠循環(huán)血，利用流式細胞計數(shù)及RT-PCR法，對eGFP-ADSCs動

6、員入循環(huán)血的情況加以分析。并于細胞移植后的21d，分別取三組大鼠血供豐富、氧分壓較高的實質(zhì)性器官——肺組織，進行冰凍切片，于共聚焦纖維鏡下觀察eGFP-ADSCs在肺部組織中的分布，利用RT-PCR檢測肺組織中eGFP基因的表達情況。
　　6.實驗過程中，分別于創(chuàng)傷后1d、3d、7d、14d、21d，觀察記錄兩組創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)面愈合的情況，計算創(chuàng)面愈合率;并于創(chuàng)傷后7d采集兩組大鼠創(chuàng)面組織進行CD31免疫組化染色，比較兩組創(chuàng)面組織中毛

7、細血管密度。
　　結(jié)果：
　　1.倒置顯微鏡下觀察，分離培養(yǎng)的大鼠ADSCs呈梭型或多角形，流式細胞技術(shù)檢測ADSCs表面高表達間充質(zhì)干細胞的表面標志物CD29、CD90;基本不表達造血及內(nèi)皮細胞表面標志物標記物CD34、CD45。體外成脂誘導培養(yǎng)14d后，油紅O染色陽性，證明其具有成脂分化能力;體外成骨誘導培養(yǎng)28d后，茜素紅染色陽性，證明其具有成骨分化的能力。
　　2.Lentivirus-eGFP轉(zhuǎn)染第3代ADS

8、Cs，96h時，細胞的綠色熒光表達程度達到高峰，此后維持在較高水平穩(wěn)定表達。連續(xù)傳代培養(yǎng)至第9代，細胞綠色熒光表達情況仍無明顯變化。轉(zhuǎn)染一周后，經(jīng)流式細胞儀檢測，Lentivirus-eGFP轉(zhuǎn)染后ADSCs的eGFP陽性表達率為81.92％(圖2-4)，可滿足本實驗的需求。MTT檢測結(jié)果顯示Lentivirus-eGFP轉(zhuǎn)染后的ADSCs與未轉(zhuǎn)染的ADSCs在細胞活性方面差異無統(tǒng)計學意義。對eGFP-ADSCs進行多向分化能力檢測，體

9、外成脂誘導培養(yǎng)14d后，油紅O染色陽性，體外成骨誘導培養(yǎng)28d后，茜素紅染色陽性，證明慢病毒轉(zhuǎn)染并未對其多向分化能力造成影響。
　　3.流式細胞結(jié)果顯示，ADSCs在體外培養(yǎng)傳至第3代(P3 ADSCs)，其表面SDF-1受體CXCR4、CXCR7的陽性表達率很低，分別為3.0％、4.1％，經(jīng)SDF-1處理2d后，P3 ADSCs表面CXCR4、CXCR7的陽性表達率明顯上調(diào)至33.7％、26.4％。Western blot實驗結(jié)

10、果同流式細胞結(jié)果基本一致，P3 ADSCs中CXCR4與CXCR7表達水平較低，經(jīng)SDF-1處理后表達明顯提高。因此說明經(jīng)SDF-1誘導可有效提高傳代后ADSCs表面CXCR4與CXCR7的表達水平。
　　4.Transwell細胞遷移實驗中，當下室加入SDF-1后，ADSCs細胞遷移數(shù)目明顯增加，SDF-1濃度為0ug/L、1ug/L、10ug/L、100ug/L時，ADSCs的細胞遷移率分別為9.77％、13.45％、28.1

11、4％、49.14％，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，證明了SDF-1在體外對ADSCs的遷移有誘導作用，且在0-100ug/L的范圍內(nèi)，誘導作用呈正相關(guān)關(guān)系，即SDF-1濃度越高ADSCs遷移越明顯。
　　5.Elisa法檢測組織中SDF-1含量顯示，未致創(chuàng)大鼠所取的組織中即正常皮膚組織亦構(gòu)成性地表達SDF-1，但表達水平較低，在皮膚致創(chuàng)后即刻至第24h，創(chuàng)傷組織中SDF-1水平呈上調(diào)趨勢，24h時出現(xiàn)SDF-1水平的小高

12、峰，此后在24h-72h間，SDF-1的表達略有下調(diào)，72h-7d間SDF-1水平重又上開，7d時達到整個愈傷過程的最高峰，隨后SDF-1水平隨創(chuàng)傷的愈合逐漸下降。經(jīng)外源性SDF-1干預后，創(chuàng)傷組織SDF-1水平在24h-7d間呈穩(wěn)定上升趨勢，未出現(xiàn)明顯波動，7d后直至21d，隨創(chuàng)面愈合，SDF-1水平顯著下降。
　　6.共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細胞移植后的第1天，eGFP-ADSCs開始少量出現(xiàn)在大鼠創(chuàng)傷組織中，隨著時間的遷移，

13、eGFP-ADSCs細胞量逐漸增多，并大致分布于表皮組織、腺體及血管周圍。我們利用ImagePro Plus圖像軟件對切片綠熒光強度進行分析，結(jié)果顯示，SDF-1干預過的創(chuàng)傷大鼠，其創(chuàng)面組織中eGFP-ADSCs的含量在3d、7d、14d及21d均高于未予SDF-1干預的創(chuàng)傷大鼠。RT-PCR檢測各組創(chuàng)傷組織中eGFP基因的表達情況，其結(jié)果與冰凍切片的觀察結(jié)果基本吻合。細胞移植后第21d，對各組大鼠的肺部組織取材進行冰凍切片及RT-PC

14、R檢測，結(jié)果顯示，未創(chuàng)傷大鼠肺組織中eGFP-ADSCs含量較另外兩組明顯較多，其中SDF-1干預的創(chuàng)傷大鼠肺組織中eGFP-ADSCs含量最少。
　　7.流式細胞分析結(jié)果提示，創(chuàng)傷組大鼠及SDF-1干預的創(chuàng)傷組大鼠與空白對照組大鼠相比，循環(huán)血中eGFP-ADSCs含量較多;RT-PCR檢測循環(huán)血中eGFP基因表達情況顯示，各時間點循環(huán)血中eGFP基因的表達情況:SDF-1干預的創(chuàng)傷組大鼠＞創(chuàng)傷組大鼠＞對照組大鼠。
　　8.

15、移植ADSCs的創(chuàng)傷大鼠在給予外源性SDF-1處理后，其創(chuàng)面愈合速度較未予SDF-1處理的加快，SDF-1處理組的創(chuàng)面愈合率在傷后7d、14d均高于對照組。創(chuàng)傷后7d，取大鼠創(chuàng)面組織進行CD31免疫組化染色，結(jié)果顯示，SDF-1處理后的創(chuàng)傷組織中毛細血管密度明顯高于未予SDF-1處理的創(chuàng)傷組織。
　　結(jié)論：
　　1.利用攜帶eGFP基因的慢病毒轉(zhuǎn)染ADSCs獲得eGFP標記的ADSCs，可穩(wěn)定表達eGFP綠色熒光，且不受細胞

16、傳代增殖分化的影響，轉(zhuǎn)染后ADSCs的生物學特性亦未受明顯影響，因此可滿足動物體內(nèi)實驗的需求。
　　2.體外培養(yǎng)傳代的ADSCs至P3(第三代)時，其表面SDF-1受體CXCR4及CXCR7的陽性表達率很低，但在基礎培養(yǎng)基中加入SDF-1誘導培養(yǎng)2d后，其表面CXCR4及CXCR7的陽性表達率可明顯提高。在體外，SDF-1可促進ADSCs的跨膜遷移，在0-100ug/L的范圍內(nèi)，隨SDF-1濃度的提高，ADSCs的遷移越明顯。