東方肉座菌EU7-22木聚糖酶基因克隆與異源表達(dá).pdf

1、木聚糖是一種多聚五碳糖，是半纖維素的主要成份，廣泛的分布于植物細(xì)胞壁中，是除纖維素外自然界中最為豐富的可再生資源多糖，約占植物生物質(zhì)總量的15％～35％。木聚糖主鏈通過β-1，4-糖苷鍵將木糖殘基連接而成，側(cè)鏈上帶有不同的取代基。由于木聚糖的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，它的完全降解需要多步酶促反應(yīng)完成。內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶(EC3.2.1.8)是最重要的酶之一，作用于木聚糖主鏈內(nèi)β-1，4-糖苷鍵，生成木寡糖和木糖。由于木聚糖酶具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景

2、，已成為國(guó)內(nèi)外科研的熱點(diǎn)，不同微生物來源的木聚糖酶基因已被克隆并進(jìn)行異源表達(dá)。為獲得優(yōu)質(zhì)的低聚木糖資源，就必須獲得性狀優(yōu)良的產(chǎn)木聚糖酶工程菌株。
　　 本文以本實(shí)驗(yàn)室分離保存的東方肉座菌（Hypocreaorientalis）EU7-22為研究對(duì)象，該菌株具有優(yōu)良的纖維素酶和半纖維素酶活性。從菌株EU7-22中克隆得到β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶基因xynⅠ和xynⅡ的cDNA序列。根據(jù)SignalP-4.0軟件對(duì)兩種木聚糖酶的蛋白

3、質(zhì)N末端序列分析，刪除木聚糖酶基因中的信號(hào)肽序列。將編碼成熟木聚糖酶的基因片段xynⅠ和xynⅡ分別重組到畢赤酵母(Pichiapastoris)高效表達(dá)載體pPIC9K上，經(jīng)BglⅡ線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115，獲得重組酵母菌株X1B1和X2B6。菌株X1B1在1％的甲醇誘導(dǎo)下培養(yǎng)144h，達(dá)到最大酶活174IU/mL，其最適反應(yīng)溫度50℃，最適反應(yīng)pH為6.0;X2B6在1％的甲醇誘導(dǎo)下培養(yǎng)144