禾谷鐮刀菌木聚糖酶基因的克隆與特征分析以及小麥靶蛋白初步篩選.pdf

1、小麥赤霉病主要由禾谷鐮刀菌引起，其有性階段為玉蜀季赤酶（Gibberellazeae）廣泛分布于世界溫暖潮濕地區(qū)，是一種危害多種糧食作物的病害。近年來(lái)，在黃淮海平原麥區(qū)和西北麥區(qū)也多次發(fā)生大流行，造成很大損失。小麥赤霉病不僅使糧食產(chǎn)量大幅度下降，而且禾谷科鐮刀菌還能夠產(chǎn)生多種單端孢霉烯族毒素（Trichothecenes）。這類毒素能夠極大的抑制真核生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的生物合成，破壞人和動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，使人、畜中毒。研究禾谷科鐮刀菌和小麥宿

2、主互作的分子機(jī)制，尋找一些致病或抗病相關(guān)基因，對(duì)赤霉病的防治有著重要意義。
　　 禾谷鐮刀菌在侵染宿主過(guò)程中分泌多種細(xì)胞壁降解酶類如纖維素酶、木聚糖酶和果膠質(zhì)酶等。由于禾本類植物的細(xì)胞壁的主要成分是半纖維素，而木聚糖又是半纖維素的主要成分，所以木聚糖酶在小麥穗部組織發(fā)生病理變化過(guò)程中起到重要作用。鐮刀菌PH-1已經(jīng)完成全基因組測(cè)序并公布，通過(guò)基因組序列分析設(shè)計(jì)引物從鐮刀菌中克隆出12個(gè)木聚糖酶基因。分析了禾谷鐮刀菌在侵染小麥宿主

3、和未侵染小麥宿主情況下這12個(gè)木聚糖酶基因的表達(dá)情況;并將這12個(gè)木聚糖酶基因構(gòu)建成誘餌，利用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)已構(gòu)建好的抗病品種蘇麥3號(hào)酵母文庫(kù)進(jìn)行篩選。研究主要結(jié)果如下:
　　 1、從侵染小麥后的禾谷鐮刀菌中克隆出12個(gè)木聚糖酶基因。并對(duì)克隆到的木聚糖酶基因在侵染小麥宿主和未侵染小麥宿主情況下進(jìn)行半定量RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)除FG07639在侵染后下調(diào)，其余均表現(xiàn)為侵染后上調(diào)。
　　 2、以克隆到的12個(gè)木聚糖酶基因分

4、別構(gòu)建成誘餌載體pGBKT7-xylan，經(jīng)毒性檢測(cè)證明新構(gòu)建的誘餌載體均無(wú)毒性。經(jīng)轉(zhuǎn)錄自激活檢測(cè)發(fā)現(xiàn)除00184BKT7外，其余誘餌質(zhì)粒均無(wú)轉(zhuǎn)錄自激活現(xiàn)象?？勺鳛檎T餌用于進(jìn)一步的雙雜交篩選研究。
　　 3、利用11個(gè)無(wú)轉(zhuǎn)錄自激活的pGBKT7-xylan誘餌載體對(duì)蘇麥3號(hào)小麥酵母表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選。共篩選出5個(gè)與pGBKT7-xylan相互作用的蛋白片段，分別編碼為類鈣脂質(zhì)結(jié)合蛋白、翻譯延伸因子、應(yīng)激反應(yīng)蛋白、Subtilase

5、蛋白酶和小麥V-ATPase亞基G。靶標(biāo)蛋白的功能區(qū)主要涉及植物跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯延伸、應(yīng)激防御及細(xì)胞凋亡等方面。后續(xù)的工作可以利用基因克隆技術(shù)進(jìn)行全長(zhǎng)克隆，通過(guò)定點(diǎn)突變等研究相互作用的位點(diǎn)及作用方式，闡明關(guān)鍵氨基酸的作用。
　　 4.本實(shí)驗(yàn)室在前期通過(guò)酵母雙雜交證明了酯酶基因FGL1與小麥中親免蛋白（命名為T(mén)aFKBP12）在酵母中存在相互作用，通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)(BIFC)證實(shí)在植物細(xì)胞中二者也發(fā)生相互作用。在動(dòng)物和人體內(nèi)它