SOX5維持非小細(xì)胞肺癌惡性表型的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：肺癌是發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)所占比率最高。腫瘤細(xì)胞自我更新、快速增殖、高侵襲遷移能力等惡性表型是NSCLC局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的根本原因。因此，深入研究NSCLC惡性表型的維持機(jī)制，為闡明NSCLC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找特異性治療靶點(diǎn)具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子SOX2能與Hippo信號(hào)通路中的關(guān)鍵效應(yīng)分子YAP1相互作用促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)

2、展。性別決定區(qū)Y框蛋白5(Sex determining region Y-box5，SOX5)同屬于SOX超基因家族中的一員，其也異常表達(dá)于多種腫瘤并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲遷移等多種惡性表型，但SOX5在NSCLC中的表達(dá)情況及其在腫瘤發(fā)生演進(jìn)中發(fā)揮的作用目前尚不清楚。因此，本研究旨在探討SOX5在NSCLC中的表達(dá)情況及其在維持NSCLC惡性表型中發(fā)揮的作用及其潛在的機(jī)制。
　　方法：在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中分析SOX5的表達(dá)與N

3、SCLC患者的預(yù)后關(guān)系，應(yīng)用定量實(shí)時(shí)多聚酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)和Western blot檢測(cè)SOX5在人支氣管上皮樣細(xì)胞（human bronchial epithelial cells，HBE）和3種NSCLC細(xì)胞株(A549、H1299、H1975)以及腫瘤球與單層腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況。采用慢病毒感染A549和H1975細(xì)胞，經(jīng)qR

4、T-PCR和Western blot驗(yàn)證干擾效率，構(gòu)建SOX5敲低和過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株。分別應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)、CCK-8實(shí)驗(yàn)、成球試驗(yàn)、transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和免疫熒光偽足染色探討敲低和過(guò)表達(dá)SOX5后對(duì)A549和H1975細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響，同時(shí)采用Western blot探討敲低和過(guò)表達(dá)SOX5后對(duì)細(xì)胞干性標(biāo)志物OCT4、NANOG、SOX2以及侵襲、遷移相關(guān)蛋白MMP2、VIMENTIN、SLUG的影響

5、。進(jìn)一步在裸鼠皮下注射敲低SOX5-A549細(xì)胞建立移植瘤模型，測(cè)定瘤體大小和重量，免疫組化檢測(cè)瘤體內(nèi)SOX5、YAP1、SOX2和MMP2的表達(dá)情況。應(yīng)用成球試驗(yàn)、transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和免疫熒光偽足染色探討YAP1對(duì)NSCLC惡性表型的影響，Western blot探討敲低YAP1后對(duì)干性標(biāo)志物OCT4、NANOG、SOX2以及侵襲、遷移相關(guān)蛋白MMP2、VIMENTIN、SLUG的影響。機(jī)制上，應(yīng)用免疫共沉淀(C

6、o-Immunoprecipitation，Co-IP)、細(xì)胞免疫熒光染色及核漿分離實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與SOX5相互作用的蛋白。同時(shí)在敲低YAP1-A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SOX5探究SOX5是否可拯救敲低YAP1所發(fā)揮的效應(yīng)。
　　結(jié)果：1.通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)SOX5的NSCLC患者預(yù)后不良;qRT-PCR和Western blot中，SOX5均高表達(dá)于3種NSCLC細(xì)胞株而低表達(dá)于HBE，且相對(duì)于單層細(xì)胞，SOX5在腫瘤球里表達(dá)

7、量更高。2.慢病毒感染A549和H1975細(xì)胞后，qRT-PCR和Western blot顯示敲低SOX5后SOX5表達(dá)降低，而過(guò)表達(dá)SOX5后SOX5表達(dá)上調(diào)，成功構(gòu)建SOX5敲低和過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株。3.克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示：敲低SOX5后克隆形成體積變小，數(shù)量減少，細(xì)胞增殖活性減弱，過(guò)表達(dá)SOX5后克隆形成體積增大，數(shù)量增多，細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)。4.成球試驗(yàn)顯示：敲低SOX5后A549和H1975細(xì)胞形成的腫瘤球體積變小，

8、數(shù)量減少，過(guò)表達(dá)SOX5后形成的腫瘤球體積增大，數(shù)量增多。5.Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和免疫熒光偽足染色實(shí)驗(yàn)顯示：敲低SOX5后A549和H1975細(xì)胞通過(guò)transwell小室侵襲細(xì)胞減少，傷口愈合率減慢，并減少了偽足的生成，過(guò)表達(dá)SOX5后通過(guò)transwell小室侵襲細(xì)胞增多，傷口愈合率加快，偽足生成增加。6.Western blot顯示：敲低SOX5后干性標(biāo)志物OCT4、NANOG、SOX2以及侵襲和遷移相關(guān)蛋白

9、MMP2、VIMENTIN、SLUG的表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)SOX5后這些蛋白的表達(dá)增加。7.體外實(shí)驗(yàn)顯示敲低SOX5可減慢NSCLC細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)速度和減小腫瘤體積，移植瘤免疫組化提示敲低SOX5后YAP1、SOX2和MMP2的表達(dá)減少。8.NSCLC細(xì)胞中敲低YAP1后，NSCLC細(xì)胞成球能力減弱，通過(guò)transwell小室的細(xì)胞減少，劃痕愈合的速率減慢，細(xì)胞侵襲性偽足減少。Western blot顯示：敲低YAP1后干性標(biāo)志物OCT4、

10、NANOG、SOX2以及侵襲和遷移相關(guān)蛋白MMP2、VIMENTIN、SLUG的表達(dá)下調(diào)。9.SOX5和YAP1均在腫瘤球里高表達(dá)，Western blot顯示：YAP1的表達(dá)隨著SOX5的改變而發(fā)生相應(yīng)改變，而YAP1的下調(diào)也可引起SOX5的下調(diào)。10.Co-IP實(shí)驗(yàn)顯示在NSCLC細(xì)胞中SOX5與YAP1形成復(fù)合物相互作用，免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示SOX5與YAP1在細(xì)胞核共定位，核漿分離實(shí)驗(yàn)顯示：過(guò)表達(dá)SOX5可增加YAP1進(jìn)入細(xì)胞核，而