YAP在Hippo與Wnt通路交互中的作用及其對(duì)非小細(xì)胞肺癌惡性表型的影響.pdf

1、Large tumor suppressor(LATS)是一種最早從果蠅中出的絲氨酸/酪氨酸激酶。近來(lái)，LATS被認(rèn)為是Hippo信號(hào)通路的重要成員之一。而Hippo信號(hào)通路被認(rèn)為是調(diào)控器官大小及細(xì)胞增殖的重要通路。Yes associated protein(YAP)是該信號(hào)通路下游的核心效應(yīng)因子，并被認(rèn)為是潛在的促癌因子。
　　目的：
　　在本研究中將進(jìn)一步研究YAP對(duì)Dvl2的影響，進(jìn)一步探索它們?cè)赪nt信號(hào)通路與Hi

2、ppo信號(hào)通路的交互中可能的意義及深入分析其作用機(jī)制。
　　方法：
　　一、患者信息和樣本
　　136例非小細(xì)胞肺癌及30例配對(duì)癌旁正常肺組織（距腫物邊界大于5cm）標(biāo)本均來(lái)自于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科的存檔蠟塊，時(shí)間為1999-2006年。術(shù)前均未接受放化療。其中患者男性為76例，女性為60例，年齡從28-76歲，平均年齡是49歲。所有樣品的病理診斷按照WHO2004分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行重新評(píng)估。
　　二、Cel

3、l Iines
　　所有細(xì)胞系都用含10％的小牛血清及100U/mL的青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基并置于37℃，5％濃度的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　三、免疫組織化學(xué)
　　所有的切除組織經(jīng)10％中性福爾馬林固定及石蠟包埋后，制成4微米厚的切片。切片然后經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟及梯度酒精脫水后，利用LATS1抗體進(jìn)行染色。染色采用S-P系統(tǒng)，顯示系統(tǒng)采用DAB顯色，以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。每張切片均隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每

4、個(gè)視野均計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞。然后根據(jù)計(jì)數(shù)細(xì)胞著色的百分比，我們將LATS1的表達(dá)被劃分成五個(gè)等級(jí):0分（無(wú)細(xì)胞著色），1分(1-25％的細(xì)胞)，2分(26-50％的細(xì)胞)，3分（51-75％的細(xì)胞），4分（76％以上的細(xì)胞）。再根據(jù)細(xì)胞著色的強(qiáng)度，我們將LATS1的表達(dá)又劃分成4個(gè)等級(jí):0分（無(wú)細(xì)胞著色），1分（細(xì)胞弱著色），2分（細(xì)胞中等著色），3分（細(xì)胞強(qiáng)著色）。
　　四、Western Blot
　　采用裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行

5、充分裂解，提取其總蛋白或者核漿蛋白分離后提取蛋白，然后利用Bradford法進(jìn)行提取蛋白的定量。
　　五、質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染
　　質(zhì)粒p2xFlag CMV2 Lats1，Super8x TOP Flash和Super8x FOP Flash購(gòu)買于Addgene公司，SiYAP，SiLATS1購(gòu)買于Santa Cruz公司。Flag-Dvl2質(zhì)粒及剪切體，GFP-YAP質(zhì)粒及剪切體，myc-CK1ε質(zhì)粒購(gòu)買于中美泰和生物技術(shù)公司

6、。將相關(guān)質(zhì)粒按照相關(guān)說(shuō)明利用Lipofectamine3000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)。之后48h或72h利用Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　六、免疫熒光實(shí)驗(yàn)
　　細(xì)胞經(jīng)4％多聚甲醛固定，用5％BSA封閉1小時(shí)后，加入一抗Dvl2及LATS1,p-Ser127 YAP及YAP后，4℃孵育過(guò)夜，然后用山羊抗兔/鼠二抗、羅丹明二抗孵育。細(xì)胞核采用DAPI染色。
　　七、M

7、TT實(shí)驗(yàn)
　　轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔板，每孔約2000個(gè)左右細(xì)胞，用含10％血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。每孔加入20微升的5 mg/ml MTT(Thiazolyl Blue)溶液，在37℃孵育4小時(shí)后，去除溶液，用150微升的DMSO溶解生成的MTT結(jié)晶，用分光光度計(jì)檢測(cè)490nm波長(zhǎng)的吸收峰值進(jìn)行定量。
　　八、基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)
　　采用一個(gè)24孔的含有8μ m微孔的Transwell小室(Corning，NY，USA

8、)，上室中鋪有基質(zhì)膠(BD Biosciences)。轉(zhuǎn)染后48h后，將5×105個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)入到不含血清的上室，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，將表面非侵襲的細(xì)胞用棉簽擦掉，將剩余細(xì)胞用4％甲醛固定，然后進(jìn)行蘇木素染色。隨機(jī)選取10個(gè)視野將侵襲到小室下的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，然后取平均值。
　　九、集落形成實(shí)驗(yàn)
　　轉(zhuǎn)染或干擾后48h的細(xì)胞，接種到6厘米細(xì)胞培養(yǎng)皿中（每皿為1000個(gè)細(xì)胞）孵育12天。吉姆薩染色后計(jì)數(shù)超過(guò)50個(gè)細(xì)

9、胞的集落數(shù)。
　　十、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
　　提取約200ug蛋白，加入足夠量的抗體，4℃輕搖過(guò)夜，然后加入25 uL A/G蛋白磁珠(Beyotime，Jiangsu，China)4℃輕搖4h.然后將混合物1500×94℃離心5分鐘，然后將上清去掉。將沉淀用冰浴的RIPA緩沖液洗3次，加入樣品緩沖液，在沸水中煮5min使免疫復(fù)合物與磁珠解離。然后，離心收集上清，待進(jìn)一步進(jìn)行Westernblot分析。
　　十一、雙熒光素

10、酶報(bào)告基因分析
　　在24孔板內(nèi)轉(zhuǎn)染0.5μg的Super8x TOP Flash或Super8x FOP Flash以及50ng對(duì)照質(zhì)粒pRL-TK，在37℃孵育30小時(shí)后，按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行操作。
　　十二、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　結(jié)果：
　　一、LATS1在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)下降，并與預(yù)后不良相關(guān)
　　與正常支氣管上皮中高表達(dá)相比，LATS1在肺癌組織中表達(dá)顯著降低。LATS1的表達(dá)與肺癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

11、及較好預(yù)后相關(guān)。LATS1在支氣管上皮細(xì)胞HBE呈高表達(dá)，而在肺癌細(xì)胞系中，低表達(dá)或缺失表達(dá)可見(jiàn)于H460，H157，A549，LK-2，H1299，PC9，H3255，A973，AGZY-83-a和LH7細(xì)胞，僅在LTE，SPC和 BE1細(xì)胞中高表達(dá)。
　　二、LATS1能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力
　　在H1299及SPC細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染及干擾LATS1，發(fā)現(xiàn)LATS1能抑制肺癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力。
　　三、L

12、ATS1可能通過(guò)調(diào)控YAP的磷酸化水平及核漿定位，影響肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲
　　在H1299細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染LATS1后能夠增加YAP蛋白的磷酸化水平，并能顯著減少YAP蛋白的核表達(dá)。反之，在SPC細(xì)胞中，干擾LATS1后，能夠降低磷酸化YAP的表達(dá)，并顯著增加YAP的核表達(dá)水平。
　　四、LATS1可能通過(guò)調(diào)控YAP的磷酸化而抑制Wnt通路活性
　　H1299細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LATS1，p-Ser127 YAP上調(diào)，Wnt通路

13、活性下調(diào)。而轉(zhuǎn)染LATS1的同時(shí)干擾YAP能夠幾乎逆轉(zhuǎn)LATS1對(duì)Wnt通路抑制作用，說(shuō)明LATS1主要依賴YAP而調(diào)節(jié)Wnt通路。但是，如果在H1299細(xì)胞中轉(zhuǎn)染磷酸化突變質(zhì)粒YAP127A，Wnt通路活性則上調(diào)。這表明YAP對(duì)Wnt通路活性的抑制，主要通過(guò)其自身的磷酸化。
　　五、LATS1使YAP磷酸化上調(diào)后，可抑制Dvl2的磷酸化及入核
　　在H1299細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LATS1后，磷酸化YAP上調(diào)的同時(shí)伴有Dvl2磷酸化

14、的下調(diào)。而轉(zhuǎn)染干擾LATS1的同時(shí)，干擾YAP則Dvl2磷酸化下調(diào)則不明顯，說(shuō)明LATS1對(duì)通過(guò)YAP磷酸化而實(shí)現(xiàn)Dvl2磷酸化抑制。在H1299細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染LATS1及YAP-S127A后，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)LATS1后顯著增加YAP及Dvl2的漿表達(dá)，并降低兩者的核表達(dá)水平，而轉(zhuǎn)染127A后，YAP及Dvl2核表達(dá)水平明顯升高。
　　六、YAP與CK1ε均能結(jié)合與Dvl2的PDZ結(jié)構(gòu)域
　　通過(guò)免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，在H1299細(xì)胞

15、系中內(nèi)源性YAP可以與Dvl2蛋白結(jié)合。而通過(guò)免疫熒光發(fā)現(xiàn)，在H1299細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染LATS1后，YAP主要定位于胞漿，并與Dvl2在胞漿內(nèi)存在共定位。分別構(gòu)建YAP及Dvl2的剪切體，然后進(jìn)行免疫共沉淀后發(fā)現(xiàn)，YAP的ww結(jié)構(gòu)域及PDZ結(jié)合基序與Dvl2的PDZ結(jié)構(gòu)域及PY基序結(jié)合;而Dvl2的PDZ結(jié)構(gòu)域同樣可與CK1ε的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
　　七、YAP對(duì)Dvl2磷酸化及入核的影響依賴于YAP與Dvl2的結(jié)合
　　在H

16、1299細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染YAP剪切體后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染野生型YAP后Dvl2的磷酸化明顯下降，并且高于△WW，△PDZ-BD及△WW&△PDZ-BD對(duì)Dvl2的磷酸化的抑制程度。同時(shí)，轉(zhuǎn)染YAP剪切體后，提取核蛋白后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染野生型YAP對(duì)Dvl2入核的抑制程度高于△WW，△PDZ-BD及△WW&△PDZ-BD對(duì)Dvl2入核的抑制。該結(jié)果表明，YAP對(duì)Dvl2磷酸化及入核的影響依賴于YAP與Dvl2的結(jié)合。
　　八、YAP與CK1ε競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合

17、Dvl2
　　H1299細(xì)胞系中梯度轉(zhuǎn)染LATS1后，磷酸化YAP增加，同時(shí)Dvl2與YAP結(jié)合增加。而梯度轉(zhuǎn)染CK1ε后，Dvl2與YAP結(jié)合明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1、LATS1在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)下調(diào)，并與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有顯著相關(guān)性。
　　2、LATS1能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖及侵襲。
　　3、LATS1蛋白可能通過(guò)調(diào)控YAP磷酸化水平及核漿定位而影響肺癌的增殖與侵襲能力。