間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)不同惡性表型腫瘤細(xì)胞的作用與機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及意義:
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(Mensenchymal Stem Cell，MSCs)是一類主要存在于全身結(jié)締組織或器官間質(zhì)的具有高度自我更新與多向分化能力的干細(xì)胞。由于其具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，且有損傷與炎癥趨向性，可參與組織修復(fù)與再生，因此在多種疾病的治療研究中有廣泛的應(yīng)用前景。MSCs在腫瘤生物治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值也逐步為人們所認(rèn)識(shí)，主要是利用了MSCs的免疫抑制功能及腫瘤趨向性的特點(diǎn)，例如在白血病患者骨髓移植與

2、腫瘤靶向治療研究中MSCs可充當(dāng)輔助治療細(xì)胞或靶向治療載體。然而目前MSCs對(duì)不同惡性表型腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚不明確，因此MSCs在腫瘤治療應(yīng)用中的安全性仍存在爭(zhēng)議。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)與MSCs共培養(yǎng)后不同惡性表型腫瘤細(xì)胞基因型變化不同，其中多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白(polypyrimidine tract binding protein，PTB)表達(dá)水平的變化存在顯著差異。PTB是一種在細(xì)胞內(nèi)部參與mRNA代謝過(guò)程的蛋白質(zhì)，在多數(shù)腫

3、瘤組織中表達(dá)高于正常組織，被認(rèn)為是腫瘤治療的潛在基因靶點(diǎn)。目前PTB的表達(dá)水平對(duì)腫瘤惡性程度的影響存在爭(zhēng)議，可能與腫瘤細(xì)胞的類型和生物學(xué)特性有關(guān)。研究MSCs對(duì)不同惡性表型腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及相關(guān)調(diào)控機(jī)制，并明確PTB在其中發(fā)揮的作用，可為MSCs在不同類型腫瘤治療研究中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為PTB作為腫瘤治療基因靶點(diǎn)的有效性和安全性提供實(shí)驗(yàn)參考。
　　研究目的:
　　1.明確骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對(duì)不同

4、惡性表型人結(jié)直腸癌細(xì)胞在體外和體內(nèi)的影響，探討MSCs對(duì)不同惡性表型腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的調(diào)控作用及機(jī)制;并通過(guò)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)對(duì)不同惡性表型乳腺癌細(xì)胞的體外作用進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2.明確BMSCs與不同惡性表型人結(jié)直腸癌細(xì)胞隔離共培養(yǎng)前后PTB及其相關(guān)信號(hào)通路中信號(hào)分子表達(dá)水平的變化，探討MSCs差異性調(diào)控不同惡性表型腫瘤細(xì)胞中PTB表達(dá)水平的機(jī)制;并通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的shRNA敲減技術(shù)研究PTB在不同惡性表型腫瘤細(xì)胞中

5、的功能。
　　研究方法:
　　1.BMSCs對(duì)不同惡性表型人結(jié)直腸癌細(xì)胞的作用研究
　　體外培養(yǎng)不同惡性表型人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29與HCT116，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài);通過(guò)MTS法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力;利用transwell法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力;運(yùn)用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力;并用real-time PCR定量檢測(cè)上皮類(E-cadherin)和間充質(zhì)類(Vimentin)細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)，鑒定HT2

6、9與HCT116細(xì)胞的生物學(xué)特性;再采用全骨髓血貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)健康志愿者髂骨骨髓來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derivedmesenchymal stem cell，BMSCs)，經(jīng)體外擴(kuò)增2代后分別與HT29和HCT116進(jìn)行隔離共培養(yǎng)，在第3天和5天比較共培養(yǎng)組與對(duì)照組HT-29和HCT116的細(xì)胞形態(tài)、增殖、侵襲、軟瓊脂克隆形成能力以及腫瘤惡性相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)等指標(biāo)的差異，探討B(tài)MSCs對(duì)HT29和HC

7、T116生物學(xué)特性的差異性調(diào)控作用。最后將HT29與HCT116分別與BMSCs在體外隔離共培養(yǎng)1周后注射至裸鼠皮下，比較各組細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤時(shí)間、成瘤體積和瘤體組織的分化程度等指標(biāo)的差別。
　　2.PTB在BMSCs差異性調(diào)控HT29與HCT116中的功能研究
　　通過(guò)real-time PCR與Western Blot的方法檢測(cè)PTB及其相關(guān)信號(hào)通路中上下游信號(hào)分子基因及蛋白表達(dá)水平的變化，明確HT29與HCT116分別

8、與BMSCs共培養(yǎng)過(guò)程中PTB信號(hào)通路的變化;并用加尾法real-time PCR定量檢測(cè)相關(guān)miRNAs的表達(dá)水平，探討B(tài)MSCs差異性調(diào)控HT29和HCT116中PTB表達(dá)水平的機(jī)制。再通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的shRNA敲減技術(shù)敲低HT29和HCT116中PTB的表達(dá)，檢測(cè)HT29和HCT116生物學(xué)特性的改變，再利用real-time PCR與westernblot的方法檢測(cè)EMT調(diào)節(jié)基因、腫瘤干性基因及腫瘤惡性相關(guān)的信號(hào)通路蛋白分子表達(dá)

9、水平的變化，探討PTB在BMSCs差異性調(diào)控HT29與HCT116生物學(xué)特性中的功能。
　　3.ADSCs對(duì)不同惡性表型乳腺癌細(xì)胞作用的體外研究
　　體外培養(yǎng)不同惡性表型的乳腺癌細(xì)胞系MCF7（雌激素受體陽(yáng)性細(xì)胞）與MDA-MB-231（三陰性乳腺癌細(xì)胞），通過(guò)比較兩種細(xì)胞的形態(tài)、增殖、侵襲和軟瓊脂克隆形成能力，鑒定其生物學(xué)特性;再?gòu)恼挝g(shù)中廢棄的脂肪組織中分離培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived mes

10、enchymal stem cell，ADSCs)，經(jīng)體外擴(kuò)增3代后分別與MCF7和MDA-MB-231隔離共培養(yǎng)，在共培養(yǎng)第3天和第5天檢測(cè)共培養(yǎng)組與對(duì)照組細(xì)胞（單獨(dú)培養(yǎng)的MCF7/MDA-MB-231）形態(tài)、增殖、侵襲、軟瓊脂克隆形成能力以及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymaltransition，EMT)相關(guān)標(biāo)志基因E-cadherin與N-cadherin的表達(dá)。
　　研究結(jié)果:
　　1.BM

11、SCs對(duì)不同惡性表型人結(jié)直腸癌細(xì)胞的作用研究
　　形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示HT29具有上皮類細(xì)胞的形態(tài)特征而HCT116呈現(xiàn)較強(qiáng)的間充質(zhì)細(xì)胞特征。細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定結(jié)果顯示HT29的增殖、侵襲和軟瓊脂克隆形成能力均顯著低于HCT116。BMSCs分別與HT29和HCT116體外隔離共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)后可顯著促進(jìn)HT29的增殖、侵襲和軟瓊脂克隆形成能力，但對(duì)HCT116的影響不明顯;其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)HT29中GSK3β、AKT、STAT3和E

12、RK1/2的蛋白磷酸化水平實(shí)現(xiàn)的。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HT29與BMSCs共培養(yǎng)后成瘤時(shí)間縮短，形成的腫瘤體積增大，且分化程度降低。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，HCT116與BMSCs共培養(yǎng)前后其體內(nèi)成瘤能力未見(jiàn)顯著改變。
　　2.PTB在BMSCs差異性調(diào)控HT29與HCT116中的功能研究
　　與BMSCs體外隔離共培養(yǎng)可顯著下調(diào)HT29中PTB基因與蛋白及其上游轉(zhuǎn)錄因子c-MYC及下游細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p27和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白C

13、ASP3基因的表達(dá)，但對(duì)HCT116中PTB信號(hào)通路無(wú)顯著影響。此外，與BMSCs共培養(yǎng)后介導(dǎo)PTB表達(dá)下調(diào)的miRNAs(miR-133，miR-124，miR-339，miR-149)在HT29中的表達(dá)均顯著升高，但在HCT116中的變化不一致;敲低PTB可顯著抑制HT29的細(xì)胞增殖與克隆形成能力，上調(diào)其細(xì)胞侵襲能力，并降低HT29在裸鼠體內(nèi)的成瘤體積和瘤體組織的分化程度;其機(jī)制可能是通過(guò)改變FGFR2與CD44的選擇性剪接方式，上

14、調(diào)Twist1和ALDH1基因的表達(dá)，提高GSK3β和AKT蛋白的磷酸化水平，促進(jìn)Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（Notch intracellular domain，NICD）的合成以及降低P27蛋白的水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的;與HT29不同，敲低HCT116中PTB的水平可顯著抑制細(xì)胞的增殖、侵襲、軟瓊脂克隆形成能力和體內(nèi)成瘤能力，HCT116中ALDH1的基因表達(dá)水平以及NICD和磷酸化STAT3的蛋白表達(dá)水平也顯著下降。
　　3.ADSCs對(duì)不

15、同惡性表型乳腺癌細(xì)胞作用的體外研究
　　細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示MCF7具有典型的上皮類細(xì)胞形態(tài)特征而MDA-MB-231呈現(xiàn)較強(qiáng)的間充質(zhì)類細(xì)胞特征;生物學(xué)特性鑒定結(jié)果顯示在體外培養(yǎng)條件下MCF7的增殖、侵襲和軟瓊脂克隆形成能力均顯著低于MDA-MB-231。與ADSCs隔離共培養(yǎng)后MCF7的細(xì)胞增殖、侵襲和軟瓊脂克隆形成能力均顯著升高，EMT標(biāo)志基因E-cadherin表達(dá)下降而N-cadherin的表達(dá)增高。此外，ADSCs對(duì)惡

16、性表型高的MDA-MB-231細(xì)胞的體外增殖、侵襲、軟瓊脂克隆形成能力的影響不明顯。
　　結(jié)論:
　　1.BMSCs可通過(guò)提高GSK3β、AKT、STAT3、ERK1/2的蛋白磷酸化水平激活相關(guān)通路，促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29的增殖、侵襲、軟瓊脂克隆形成能力和體內(nèi)成瘤能力，并降低其形成瘤體組織的分化程度，但對(duì)HCT116的作用并不明顯。提示BMSCs對(duì)不同惡性表型腫瘤細(xì)胞的調(diào)控作用不同，可誘導(dǎo)低惡性表型HT29細(xì)胞向高惡性表

17、型細(xì)胞轉(zhuǎn)變，但對(duì)高惡性表型HCT116細(xì)胞的作用不明顯。
　　2.在體外隔離共培養(yǎng)條件下BMSCs可顯著抑制HT29中PTB表達(dá)及相關(guān)的信號(hào)通路。敲減PTB可提高HT29的體外侵襲能力并降低其體內(nèi)成瘤后瘤體組織的分化程度，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)FGFR2與CD44的選擇性剪接，促進(jìn)Twist1和ALDH1基因的表達(dá)，增高P-GSK3β、p-AKT、NICD并降低P27的蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)。提示PTB表達(dá)的異常降低可能是低惡性表型HT29向

18、高惡性表型轉(zhuǎn)變的一個(gè)“開(kāi)關(guān)”，BMSCs可能通過(guò)抑制PTB相關(guān)信號(hào)通路促進(jìn)HT29惡性表型的增高。
　　3.在體外隔離共培養(yǎng)條件下BMSCs對(duì)高惡性表型HCT116中PTB及相關(guān)信號(hào)通路無(wú)顯著影響。但敲減PTB可顯著抑制HCT116的細(xì)胞增殖、侵襲、軟瓊脂克隆形成和體內(nèi)成瘤能力，并降低腫瘤干性相關(guān)基因ALDH1和腫瘤惡性相關(guān)信號(hào)通路蛋白NICD與磷酸化STAT3的表達(dá)。提示PTB參與不同惡性表型的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的信號(hào)通路不同并