重組人RGD-sTRAIL的基因克隆、表達(dá)、純化及腫瘤靶向性研究.pdf

1、目的 構(gòu)建、表達(dá)融合有RGD短肽序列的人腫瘤壞死因子凋亡配體(RGD-sTRAIL)表達(dá)載體,表達(dá)產(chǎn)物RGD-sTRAIL經(jīng)純化后檢測(cè)其體外抑瘤活性以及研究體內(nèi)對(duì)腫瘤組織部位的靶向作用.方法用PCR方法擴(kuò)增融合有RGD序列的hTRAIL的114-281位氨基酸的cDNA,擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒載體pGEM3Zf(-)連接,構(gòu)建克隆載體pGEM-RGD-sTRAIL.在宿主菌DH5 α中擴(kuò)增重組質(zhì)粒,由藍(lán)白菌落篩選的方法挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒并由限

2、制性內(nèi)切酶酶譜分析、DNA序列分析兩種方法進(jìn)行鑒定正確后進(jìn)行酶切回收目的RGD-sTRAIL DNA片段,將目的基因插入pET-lla中構(gòu)建成表達(dá)載體,再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,挑取單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定.鑒定后的陽(yáng)性克隆用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和免疫學(xué)鑒定正確后,純化包涵體,進(jìn)行蛋白的變性、復(fù)性,復(fù)性后蛋白再經(jīng)離子交換和分子篩進(jìn)行純化,得到純品RGD-sTRAIL,薄層掃描儀掃描凝膠以檢測(cè)純度.純化產(chǎn)物

3、RGD-sTRAIL蛋白以不同濃度處理人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549,觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)RGD-sTRAIL的體外抗腫瘤活性.將純化后的RGD-sTRAIL和TRAIL蛋白分別經(jīng)尾靜脈注射導(dǎo)入荷瘤小鼠體內(nèi),不同時(shí)段后處死動(dòng)物后取腫瘤部位組織,通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法觀察目的蛋白在腫瘤部位的分布.結(jié)論成功構(gòu)建重組RGD-sTRAIL表達(dá)載體,并在大腸桿菌中獲得表達(dá),成功獲得包涵體復(fù)性后的純化蛋白.復(fù)性純化后的重組蛋白R(shí)GD-sTR