RGD-FasL的基因構建、表達、純化及功能分析.pdf

1、惡性腫瘤是嚴重威脅人類生命健康的頭號殺手,手術、放療和化療是治療腫瘤的常用方法。放療、化療因同時殺傷腫瘤細胞和正常細胞,副作用大,因此尋找特異、高效的腫瘤治療方法一直是腫瘤研究的熱點。肝癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤,肝癌是所有腫瘤中的第二位致死因素,肝癌的治療方法及效果對肝癌防治致關重要,近年來,隨著肝癌的發(fā)病機理和治療研究的進展,人們認識到細胞凋亡機制的異常在肝癌發(fā)生和抗腫瘤治療中起重要作用,研究發(fā)現(xiàn)很多抗腫瘤治療方法是通過誘導腫瘤

2、細胞凋亡發(fā)揮作用,因此,尋找能夠誘導肝癌細胞凋亡的活性物質,通過激發(fā)肝癌細胞的凋亡途徑,達到治療肝癌的目的是肝癌防治的有效方法之一。由于FasL具有抗腫瘤作用和多種免疫調(diào)節(jié)功能,FasL療法的臨床研究已在許多國家開展。動物實驗和臨床實驗均表明,FasL對某些腫瘤具有明顯的抑制作用；但是由于副作用較大,為FasL的臨床應用造成困難。患者常因不能耐受其毒副作用而終止用藥。為了降低FasL的副作用,臨床多采用局部用藥、聯(lián)合用藥、溫熱療法等。盡

3、可能降低FasL用藥量,增強療效而不損傷正常細胞,然而,欲從根本上解決FasL的療效問題還需要對FasL進行遺傳改造以獲得高特異性、低毒性的新一代FasL,有關這方面的工作,目前主要集中在以下兩個方面：一是根據(jù)FasL結構與功能的關系研究結果,通過遺傳操作,獲得FasL突變體,降低其毒副作用；二是將FasL與其它蛋白共同構建雙功能的融合蛋白,實現(xiàn)腫瘤靶向治療。腫瘤靶向治療是利用特異性的載體或導向系統(tǒng),將藥物或其他殺傷腫瘤細胞的活性物質選

4、擇性地運送到腫瘤部位,而不影響正常細胞、組織或器官的功能,從而提高療效、減少毒副作用。腫瘤靶向治療中治療靶點、靶向載體和效應分子的選擇是關鍵。整合素是一類膜受體家族,由α和β兩個亞單位組成。在部分腫瘤細胞或者腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞中,常特異性地高表達某些整合素,如αvβ3,而正常細胞不表達或表達量很低。整合素αvβ3在腫瘤新生血管形成、腫瘤生長和轉移過程中發(fā)揮重要作用,可以作為一類新的腫瘤治療靶點；RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天門冬

5、氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽,細胞外基質(ECM)和血液中的粘附蛋白是人體中最常見的含RGD序列的蛋白。研究發(fā)現(xiàn),大部分整合素與其配體的結合過程,是通過識別配體中所含的RGD序列來完成的。目前,利用噬菌體表面展示技術,已經(jīng)篩選出與一類與整合素αvβ3特異性結合的RGD肽,即ACDCRGDCFCG(RGD-4C),這類RGD肽可以作為腫瘤靶向載體,特異性地引導抗腫瘤藥物到達腫瘤部位,殺滅腫瘤細胞。本研究以整合素αvβ3為靶點,RG

6、D肽為靶向載體,FasL蛋白為抗腫瘤效應分子,構建雙靶向性抗腫瘤融合蛋白RGD-FasL,并檢測其生物學活性,為深入探討RGD-FasL的體內(nèi)靶向抑瘤活性及腫瘤治療應用前景奠定基礎。同時豐富了FasL在腫瘤治療中的應用形式,為腫瘤靶向治療提供了新思路。我們獲得RGD-FasL基因,構建到表達載體pGEX-5X-1,通過酶切、測序鑒定陽性重組載體。含重組質粒pGEX-5X-1/RGD-FasL的E.coli BL21DE(3)經(jīng)IPTG誘

7、導表達后,通過不同的誘導時間和誘導劑濃度對重組菌進行誘導表達,確定其最適表達條件為IPTG終濃度為0.5mmol/L、30℃誘導12 h。目的蛋白主要存在包涵體裂解液上清中,表達量占菌體總蛋白的30%以上,過GST Resin柱純化。經(jīng)SDS-PAGE分析在Mr 62 000附近有一特異條帶,符合目的蛋白理論推算值(Mr約62 700),掃描分析顯示其純度達95%以上,透析和稀釋復性制備正確折疊的融合蛋白。通過流式細胞儀檢測肝癌分子表面

8、Fas,CD61的表達,通過體外粘附實驗證實RGD-FasL具有靶向性,從而為進一步實驗提供了有力基礎。MTT比色實驗證實,RGD-FasL能抑制小鼠肝癌細胞H22和人肝癌H9101細胞生長,對正常小鼠肝細胞生長沒有影響；通過Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術定量分析技術和末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)方法分析證實RGD-FasL誘導H22和H9101細胞凋亡能力；體內(nèi)實驗顯示RGD-FasL

9、融合蛋白能有效抑制鼠源性肝癌的生長。在H22小鼠模型中,當RGD-FasL劑量為200mg/kg時,RGD-FasL的抑瘤率為62.5%,優(yōu)于相同劑量的FasL的抑瘤率(51.3%)：免疫組化及HE染色組織學觀察發(fā)現(xiàn)RGD-FasL能選擇性作用于腫瘤組織,誘導腫瘤細胞凋亡,而對正常組織及肝組織沒有毒副作用。本研究表明：融合蛋白RGD-FasL具有誘導肝癌細胞凋亡,抑制肝癌細胞生長的能力。同時RGD-FasL能夠特異性結合腫瘤細胞,具有腫