明膠酶介導的腫瘤靶向性rhTNF-α原核表達質粒的構建及表達產物分離純化的實驗研究.pdf

1、廣東醫(yī)學院碩士學位論文明膠酶介導的腫瘤靶向性rhTNF-α原核表達質粒的構建及表達產物分離純化的實驗研究姓名：楊明申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：侯敢;黃迪南20070501明膠酶介導的腫瘤靶向性r h T N F - a 原核表達質粒的構建及表達產物分離純化的實驗研究中文摘要腫瘤壞死因子- 旺( t u m o r n e c r o s i sf a c t o r - a ，T N T m ) 是一種多功能細

2、胞因子，具有在體內外直接殺傷腫瘤細胞的特性，是迄今為止發(fā)現的抗腫瘤細胞活性最強的細胞因子。但由于大量全身應用會產生強烈的毒副作用，使其應用于臨床抗腫瘤治療的效果并不理想。隨著腫瘤學和分子生物學技術的飛速發(fā)展，應用基因工程技術將人腫瘤壞死因子噸( h u m a n [ t l m o r n e c r o s i sf a c t o r - ·g ，h T N F 噸) 的結構進行改造，達到降低毒副作用、增強抗腫瘤活性、賦

3、予腫瘤靶向等效果，在惡性腫瘤的治療方面呈現出良好的應用前景．目的：1 ．應用基因工程技術，初步實施h T N F - a 靶向改造方案，以期獲得同時解決h T N T - a 毒副作用和腫瘤靶向性問題的r h T N F 噸；2 。構建帶有膠原蛋白( c o l l 卿) 序列，明膠酶( M M P - 2 和M M P - 9 ) 底物序列和h T N F - a 突變體基因的2 種的p E T 3 2 a ( + ) 原核表達質粒，

4、并實現在大腸桿菌加E 3中的高效表達；3 ．初步確．．立r h T N F - a 融合基因表達產物的純化方案，獲得兩種r h T N F ．．a 融合蛋白的初步純化產物．方法；1 ．重組p G E M - c o l l a g e n 質粒的構建合成人膠原蛋白序歹l j 的寡核苷酸D N A 單鏈，退火，克隆到p G E M ：r E a s y ) 員粒中，篩選陽性重組子并進行D N A 序列分析，篩選出序列正確的質粒并命名為重組

5、p G E M - ．c o l l a g c n ．2 ．重組p M D l 8 - M M P 2 - h T N F 和p M D l 8 - M M P 9 - h T N F 質粒的構建1 ) 用P C R 方法擴增得到帶有明膠酶( M M P - 2 和M M P ．9 ) 底物序列和h T N F - a突變體基因的融合基因序列。2 ) 將擴增產物通過A T 克隆法連接_ 至p M D l 8 - T 質粒中，轉化，篩選