明膠酶介導(dǎo)的腫瘤靶向性rhTNF-α原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物分離純化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、廣東醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文明膠酶介導(dǎo)的腫瘤靶向性rhTNF-α原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物分離純化的實(shí)驗(yàn)研究姓名：楊明申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：侯敢;黃迪南20070501明膠酶介導(dǎo)的腫瘤靶向性r h T N F - a 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物分離純化的實(shí)驗(yàn)研究中文摘要腫瘤壞死因子- 旺( t u m o r n e c r o s i sf a c t o r - a ，T N T m ) 是一種多功能細(xì)

2、胞因子，具有在體內(nèi)外直接殺傷腫瘤細(xì)胞的特性，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤細(xì)胞活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子。但由于大量全身應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的毒副作用，使其應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療的效果并不理想。隨著腫瘤學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，應(yīng)用基因工程技術(shù)將人腫瘤壞死因子噸( h u m a n [ t l m o r n e c r o s i sf a c t o r - ·g ，h T N F 噸) 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，達(dá)到降低毒副作用、增強(qiáng)抗腫瘤活性、賦

3、予腫瘤靶向等效果，在惡性腫瘤的治療方面呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景．目的：1 ．應(yīng)用基因工程技術(shù)，初步實(shí)施h T N F - a 靶向改造方案，以期獲得同時(shí)解決h T N T - a 毒副作用和腫瘤靶向性問(wèn)題的r h T N F 噸；2 。構(gòu)建帶有膠原蛋白( c o l l 卿) 序列，明膠酶( M M P - 2 和M M P - 9 ) 底物序列和h T N F - a 突變體基因的2 種的p E T 3 2 a ( + ) 原核表達(dá)質(zhì)粒，

4、并實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌加E 3中的高效表達(dá)；3 ．初步確．．立r h T N F - a 融合基因表達(dá)產(chǎn)物的純化方案，獲得兩種r h T N F ．．a(chǎn) 融合蛋白的初步純化產(chǎn)物．方法；1 ．重組p G E M - c o l l a g e n 質(zhì)粒的構(gòu)建合成人膠原蛋白序歹l j 的寡核苷酸D N A 單鏈，退火，克隆到p G E M ：r E a s y ) 員粒中，篩選陽(yáng)性重組子并進(jìn)行D N A 序列分析，篩選出序列正確的質(zhì)粒并命名為重組

5、p G E M - ．c o l l a g c n ．2 ．重組p M D l 8 - M M P 2 - h T N F 和p M D l 8 - M M P 9 - h T N F 質(zhì)粒的構(gòu)建1 ) 用P C R 方法擴(kuò)增得到帶有明膠酶( M M P - 2 和M M P ．9 ) 底物序列和h T N F - a突變體基因的融合基因序列。2 ) 將擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)A T 克隆法連接_ 至p M D l 8 - T 質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化，篩選