東北白鵝和籽鵝抑制素α-亞基成熟區(qū)編碼序列的克隆與原核表達(dá).pdf

1、抑制素(INH)主要抑制垂體促性腺激素FSH的合成和分泌，從而抑制了禽類的排卵和產(chǎn)蛋。本實(shí)驗(yàn)對(duì)東北白鵝和籽鵝抑制素(INH)特異性的α-亞基成熟區(qū)cDNA的克隆及其在菌株BL21(DE3)中的原核表達(dá)進(jìn)行探討，旨在為開展表達(dá)產(chǎn)物對(duì)提高家禽繁殖率的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 根據(jù)GenBank中雞卵泡抑制素α-亞基序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)該序列按大腸桿菌嗜好密碼子進(jìn)行優(yōu)化，在設(shè)計(jì)的引物兩端分別加上限制性內(nèi)切酶.SacI和XhoI的識(shí)別位點(diǎn)序列。利

2、用RT-PCR技術(shù)從東北白鵝和籽鵝卵泡的顆粒細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出抑制素α-亞基成熟區(qū)序列，經(jīng)PCR擴(kuò)增出B354 bp片段，該片段與pMD18-T Simple載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，所得陽性克隆進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定，并進(jìn)行了測(cè)序分析，得到的克隆序列與設(shè)計(jì)的序列基本一致。表明成功地獲得了抑制素α-亞基編碼序列的克隆載體。與NCBI發(fā)表的雞的相應(yīng)序列對(duì)比，東北白鵝和籽鵝核苷酸序列的同源性分別為94.44％和194

3、.74％，其氨基酸序列的同源性分別為96.5％和197.35％，說明INH-α亞基的序列在禽類間具有高度保守性。 從陽性細(xì)菌中提取質(zhì)粒，經(jīng)SacI和XhoI酶切，回收354 bp目的片段，應(yīng)用T<,4>DNA ligase連接到pET32a中，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)受體菌，提取質(zhì)粒，成功篩選出陽性表達(dá)質(zhì)粒。陽性菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，通過Trision-SDS-PAGE凝膠電泳，檢測(cè)出東北白鵝和籽鵝卵泡抑制素α-亞基編碼區(qū)的表達(dá)。將純