籽鵝和東北白鵝抑制素-活化素β-,B-亞基成熟區(qū)基因的克隆及原核表達(dá).pdf

1、本研究應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究手段和方法，對(duì)籽鵝和東北白鵝抑制素和活化素β<,B>亞基成熟區(qū)基因進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)。本試驗(yàn)采用普通的Trizol方法從籽鵝和東北白鵝卵泡組織中提取總RNA，然后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，自行設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)，成功地?cái)U(kuò)增出籽鵝和東北白鵝β<,B>亞基成熟區(qū)cDNA基因，并定向插入pMD18-T載體中，然后經(jīng)PCR鑒定及限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切鑒定，鑒定正確

2、的質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，用DNAstar軟件將所測(cè)得的序列與GeneBank上發(fā)表的雞抑制素和活化素β<,B>亞基基因序列比較，核苷酸序列基本一致，且籽鵝和東北白鵝抑制素和活化素β<,B>亞基成熟區(qū)cDNA與雞的核苷酸同源性均達(dá)到99.7％，表明所構(gòu)建的籽鵝和東北白鵝β<,B>亞基成熟區(qū)基因序列是正確的。 將篩選得到的籽鵝和東北白鵝抑制素和活化素β<,B>亞基成熟區(qū)cDNA的陽(yáng)性克隆子經(jīng)雙酶切后，連接入經(jīng)同樣內(nèi)切酶BamHⅠ和Han

3、dⅢ消化的表達(dá)載體pET-32a Vector中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-32a-IA，將篩選到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(DE3)中，在低溫條件下(28℃)用。IPTG誘導(dǎo)其進(jìn)行表達(dá)，并制備了目的蛋白的包涵體，進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，表達(dá)的蛋白帶均位于約34KDa處，籽鵝和東北白鵝INH/ACTβ<,B> 亞基成熟區(qū)基因獲得表達(dá)。 本研究獲得了籽鵝和東北白鵝INH/ACT β<,B>亞基