戊二酸致大鼠腦神經(jīng)元毒性作用的機制研究.pdf

1、第一部分
　　 第一部大鼠原代皮質神經(jīng)元培養(yǎng)與鑒定
　　 目的：探討大鼠原代皮質神經(jīng)元無血清培養(yǎng)的影響因素及優(yōu)化方法。
　　 方法：采用原代神經(jīng)元無血清培養(yǎng)，按胎鼠組、新生鼠組，胰蛋白酶消化時間0min、5min、15min組，取材環(huán)境溫度20℃組、30℃組等不同影響因素進行分組。應用臺盼藍拒染法檢測接種時神經(jīng)元存活率，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)免疫組織細胞化

2、學染色法比較各組所得神經(jīng)元純度，倒置顯微鏡動態(tài)觀察神經(jīng)元形態(tài)變化。
　　 結果：胎鼠組和新生鼠組原代神經(jīng)元狀態(tài)良好，純度和存活率均較高；結合環(huán)境溫度適當調整消化時間可提高神經(jīng)元細胞純度和細胞活性；并盡量縮短操作時間。
　　 結論：24h內新生鼠原代神經(jīng)元無血清培養(yǎng)操作性強、省時，優(yōu)化神經(jīng)元培養(yǎng)過程影響因素可提高神經(jīng)元細胞的純度和存活率。
　　 第二部戊二酸致原代培養(yǎng)大鼠紋狀體神經(jīng)
　　 元神經(jīng)毒性的體外研

3、究
　　 目的：探討戊二酸干預體外培養(yǎng)紋狀體神經(jīng)元致神經(jīng)元損傷的濃度和時間依賴性及損傷機制。
　　 方法：體外培養(yǎng)新生大鼠紋狀體神經(jīng)元，于體外培養(yǎng)7 d（DIV 7 d）行NSE免疫細胞化學染色鑒定神經(jīng)元純度，純度達90％以上。用不同濃度戊二酸孵育體外培養(yǎng)10d紋狀體神經(jīng)元24-96 h，Hoechst 33342 (-/+)熒光活細胞染色后倒置顯微鏡觀察神經(jīng)元形態(tài)變化，MTT法檢測細胞線粒體功能變化，Annexin V

4、/PI雙染流式細胞儀檢測評判戊二酸誘導紋狀體神經(jīng)元損傷類型及程度，TUNEL法及電鏡觀察細胞形態(tài)學變化，實時定量RT-PCR及Western blot初步探討凋亡相關通路。
　　 結果：神經(jīng)元純度90％以上；戊二酸處理組細胞線粒體功能受損程度呈濃度及時間依賴性改變：隨著戊二酸濃度升高、干預時間增長，神經(jīng)元損傷加重。Annexin V/PI 雙染流式細胞儀檢測凋亡，各時間組內不同濃度組與正常對照比較，50mmol/L組干預48 h

5、、72 h后凋亡率均比正常對照組顯著性增高(40.90±4.09, p=0.00; 87.63±9.17, p=0.02)，而20mmol/L濃度組干預72h與正常對照組細胞相比差異有顯著性(16.27±1.70, p=0.04)；各濃度組內干預時間比較，10、20、50mmol/L組孵育72 h比48 h細胞凋亡增加有統(tǒng)計學意義(p=0.02, 0.01, 0.00)，各組未見壞死增加。TUNEL法及電鏡從形態(tài)學上說明處理組神經(jīng)元呈凋

6、亡改變。戊二酸10、25、50mmol/L作用神經(jīng)元1h、6 h caspase-9和caspase-3 mRNA表達明顯增加，25、50mmol/L戊二酸處理24 h后神經(jīng)元caspase-9、caspase-3蛋白活化片段增加。
　　 結論：戊二酸致紋狀體神經(jīng)元損傷呈濃度-時間依賴性，通過caspase-9/-3途徑誘導紋狀體神經(jīng)元凋亡，該機制可能與戊二酸尿癥Ⅰ型紋狀體退行性變有關。
　　 第三部NMDA受體拮抗劑M

7、K-801對戊二酸致神經(jīng)元損傷的保護作用
　　 目的：研究戊二酸處理體外培養(yǎng)紋狀體神經(jīng)元致神經(jīng)元損傷的機制及NMDA受體在其中的作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)新生大鼠紋狀體神經(jīng)元，于體外培養(yǎng)7 d（DIV 7 d）行NSE免疫細胞化學染色鑒定神經(jīng)元純度，純度達90％以上。有/無NMDA受體拮抗劑預（共）孵育后，用不同濃度戊二酸孵育體外培養(yǎng)10d紋狀體神經(jīng)元24 h，MTT法檢測細胞線粒體功能變化，Annexin V/PI雙

8、染流式細胞儀檢測評判戊二酸誘導紋狀體神經(jīng)元損傷類型及程度，Western blot初步探討凋亡相關通路。實時定量PCR檢測NMDA受體亞單位（NR 1、NR 2A、NR 2B）mRNA表達水平變化。
　　 結果：神經(jīng)元純度90％以上；戊二酸處理組細胞線粒體功能受損程度呈濃度依賴性改變，NMDA受體拮抗劑MK-801可增強10、20、50mmol GA處理組的細胞活力。Annexin V/PI 雙染流式細胞儀檢測凋亡，30、50m

9、mol/L組干預24 h細胞凋亡率比正常對照組顯著性增高(41±2.66, 46.97±2.47; p<0.01)，MK-801共孵育組比同濃度GA處理組凋亡率顯著性降低(30.23±1.27, 28.37±3.32; p<0.01)，而CNQX組未能減少細胞凋亡，然而三組細胞凋亡率均比正常對照組顯著增高(p<0.01)；30mmol/L戊二酸處理24h后神經(jīng)元caspase-9、caspase-3蛋白活化片段增加，MK-801能減弱該

10、活化片段的表達。NR 1、NR 2B mRNA在不同濃度戊二酸作用下有不同程度表達減低，而NR 2A mRNA表達未見明顯變化。
　　 結論：戊二酸通過caspase-9/-3途徑以濃度-時間依賴誘導紋狀體神經(jīng)元凋亡，且此毒性作用與NMDA受體（尤其NR 1、NR 2B受體亞單位）有關，該機制可能與戊二酸尿癥Ⅰ型紋狀體退行性變有關。
　　 第四部分 慢性皮下注射戊二酸誘導大鼠紋狀體損傷機制的初步研究
　　 目的：

11、研究慢性頸背部皮下注射戊二酸致大鼠紋狀體損傷及可能的機制。
　　 方法：新生大鼠于生后低2 d隨機分為正常對照組（NS）、低劑量組（LGA）及高劑量組（HGA），并于生后第3 d開始以5μmol· g-1體重的劑量頸部皮下注射生理鹽水（NS）、戊二酸（HGA組按10μmol· g-1），早中晚3次注射。連續(xù)給藥20d，最后一次給藥后12 h，麻醉后心臟灌注4％多聚甲醛固定，取腦觀察大體形態(tài)改變，于冠狀位及矢狀位切至紋狀體層面行H

12、E染色及TUNEL染色，檢測紋狀體神經(jīng)細胞損傷。實時定量PCR檢測未經(jīng)固定紋狀體組織caspase-3、8、9、Bax、Bcl-2 mRNA表達水平變化、Western blot 檢測caspase-3蛋白酶原及活化片段表達水平。
　　 結果：生后3d LGA組、HGA組乳鼠體重與生理鹽水組無明顯差異，隨著處理時間的推移，LGA組、HGA乳鼠體重低于生理鹽水組，以HGA組乳鼠體重降低更明顯：LGA組用藥后11d體重明顯低于NS組

13、（p<0.01），而HGA組用藥后4-20d體重明顯低于NS組。3只HGA組有2只出現(xiàn)大腦半球向腦室塌陷，皮質變薄，基底神經(jīng)節(jié)與皮質間未見明顯的纖維連接，易與皮質分離，而NS組及LGA組乳鼠大腦未見明顯結構異常，NS組乳鼠大腦飽滿，有彈性，皮質和基底神經(jīng)節(jié)間可見大量白色纖維連接。HE染色發(fā)現(xiàn)HGA組間質水腫，細胞空泡樣變，血管周圍間隙增寬，細胞結構混亂。LGA組、HGA組TUNEL染色可見紋狀體區(qū)細胞大量棕黃色顆粒沉淀于細胞內，aspa