從TOCP暴露雞脊髓組織中篩選OPIDN誘發(fā)相關(guān)蛋白.pdf

1、目的:利用PMSF前干預(yù)對OPIDN影響特點(diǎn)，通過雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)，構(gòu)建OPIDN相關(guān)蛋白信息譜，篩選并鑒定TOCP誘發(fā)OPIDN相關(guān)差異表達(dá)蛋白，為探討TOCP誘發(fā)OPIDN作用機(jī)制提供靶蛋白依據(jù)。
　　 方法:取羅曼鶴雞56只，隨機(jī)分為低劑量TOCP(750mg/kg)染毒組、高劑量TOCP(1000mg/kg)染毒組、給予PMSF(40mg/kg)后再投TOCP（1000mg/kg）的PMSF前干預(yù)組以及對照組，每組

2、14只，分別觀察四組雞遲發(fā)型神經(jīng)毒性行為癥狀，并于染毒后第5天和20天，從各組8只雞中取脊髓組織用于雙向電泳和質(zhì)譜分析，而每組剩余6只雞繼續(xù)觀察遲發(fā)性神經(jīng)毒性癥狀，第23天觀察結(jié)束;OPIDN癥狀觀察結(jié)束后，處死實驗動物，選取高劑量組雞脊髓組織進(jìn)行毒理形態(tài)觀察。
　　 雙向電泳原始文件用imagemaster2Dplatinum軟件搜索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，蛋白表達(dá)差異2倍以上或0.5倍以下視為差異顯著點(diǎn)。利用質(zhì)譜分析技術(shù)對差異表達(dá)蛋白

3、點(diǎn)鑒定，通過計算機(jī)MASCOT軟件的MSMS離子方式對肽質(zhì)量指紋圖譜和分子量、等電點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索與之匹配的相關(guān)蛋白，同時查詢其功能。肽質(zhì)量指紋圖譜容許誤差0.3Da，分子量容許誤差±20％。
　　 結(jié)果:對神經(jīng)癥狀觀察的結(jié)果顯示，兩組TOCP暴露雞從染毒后第5天開始出現(xiàn)輕度遲發(fā)性神經(jīng)毒性癥狀，并隨時間推移其神經(jīng)毒性癥狀逐漸加重，第20天這些雞的平均遲發(fā)性神經(jīng)毒性癥狀評分值基本達(dá)到高峰。尤其，高劑量組雞的遲發(fā)

4、性神經(jīng)毒性癥狀較為嚴(yán)重。在染毒23天，高劑量TOCP組的6只中全部出現(xiàn)了OPIDN癥狀，而低劑量TOCP組的6只中只有3只出現(xiàn)了OPIDN癥狀。相反，PMSF前干預(yù)組和對照組雞沒有出現(xiàn)遲發(fā)性神經(jīng)毒性癥狀。通過組織病理學(xué)對TOCP暴露23天的雞神經(jīng)組織觀察，可見神經(jīng)元突起消失，髓鞘腫脹和脫髓鞘，神經(jīng)元壞死，膠原纖維增生等，出現(xiàn)具有特征性的病理學(xué)變化。進(jìn)一步從病理學(xué)角度證實了TOCP誘發(fā)雞OPIDN模型的可靠性。利用雙向電泳技術(shù)篩選OPID

5、N相關(guān)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)信息，從TOCP暴露雞脊髓神經(jīng)組織中共篩選136個與OPIDN相關(guān)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，其中上調(diào)點(diǎn)有23個，下調(diào)點(diǎn)有113個。利用質(zhì)譜分析技術(shù)，從雞脊髓組織相關(guān)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)中鑒定了14個可能與OPIDN相關(guān)的靶標(biāo)蛋白，其中下調(diào)蛋白13個:cofilin-1-B、Stathmin蛋白、髓鞘堿性蛋白(MBP)、突觸核蛋白、熱休克蛋白beta-1、胰蛋白激酶A、磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶、蘋果酸脫氫酶、精氨酸激酶、一型細(xì)胞骨架蛋白、

6、Vesicleaminetransportprotein1、塔爾羊蛋白5、電子傳遞黃素蛋白;上調(diào)調(diào)蛋白1個:神經(jīng)絲蛋白。
　　 結(jié)論:1000mg/kgTOCP暴露和40mg/kgPMSF前干預(yù)可獲得穩(wěn)定的雞OPIDN模型和PMSF干預(yù)模型。通過雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)從雞脊髓組織中篩選和鑒定了14個可能與OPIDN密切相關(guān)蛋白。其中下調(diào)蛋白包括5個神經(jīng)組織相關(guān)蛋白，4個蛋白酶類蛋白和4個其他相關(guān)蛋白。上調(diào)蛋白1個，為神經(jīng)絲蛋白。