大鼠急性脊髓損傷修復(fù)相關(guān)難溶蛋白的譜系研究.pdf

1、急性脊髓損傷主要導(dǎo)致軸突變性、神經(jīng)元壞死、膠質(zhì)瘢痕生成等，從而造成肢體麻痹、截癱。急性脊髓損傷后，脊髓內(nèi)發(fā)生的病理變化及涉及的分子機(jī)理非常復(fù)雜，多數(shù)不為人們熟知。我們需要用新的方法來(lái)研究其中錯(cuò)綜復(fù)雜的病理反應(yīng)。蛋白質(zhì)組學(xué)為我們提供了一個(gè)從蛋白質(zhì)入手的研究途徑。
　　在眾多蛋白質(zhì)中，難溶蛋白如膜蛋白、細(xì)胞器蛋白在很多病理過(guò)程中起著十分重要的作用，如細(xì)胞的相互作用與識(shí)別、離子的轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，膜蛋白還是很多藥物的作用靶點(diǎn)。脊髓

2、組織中的難溶蛋白在脊髓損傷后可能也起著關(guān)鍵的作用，它們可以為我們提供更多的理論信息，具有重要的研究意義。然而，脊髓組織中蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的相互作用使這些蛋白質(zhì)的分離和溶解難度加大。為此，我們采用分步提取法來(lái)制備蛋白樣品，期望能夠最大程度地去除可溶蛋白，富集難溶蛋白。另外，對(duì)所采用的裂解液成分和濃度進(jìn)行了調(diào)整，以提高難溶蛋白的溶解效率。
　　目的：建立正常和損傷脊髓難溶蛋白的2-DE圖，分析難溶蛋白的溶解效率及其差異表達(dá)

3、。
　　方法：采用大鼠脊髓橫斷模型，利用蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)和理論針對(duì)脊髓組織難溶蛋白進(jìn)行研究。使用分步提取法和改良的裂解液提取脊髓難溶蛋白，以雙向電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)，凝膠染色、圖象分析后選取蛋白點(diǎn)，通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)獲取肽質(zhì)量指紋譜，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢蛋白質(zhì)。隨機(jī)選擇5個(gè)蛋白進(jìn)行MALDI-TOF/TOF分析，以驗(yàn)證MALDI-TOF-MS的結(jié)果。對(duì)部分差異蛋白采用RT-PCR和Westernblot的方法在mRNA水平和蛋白水平分別進(jìn)

4、行了驗(yàn)證。最后，通過(guò)專業(yè)軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)從分子功能、生物過(guò)程和亞細(xì)胞定位三方面對(duì)所鑒定的蛋白進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：（1）成功建立重復(fù)性良好的脊髓組織難溶蛋白雙向電泳圖，2-DE考染膠顯示了約600個(gè)點(diǎn)；（2）經(jīng)圖像分析得到62個(gè)差異表達(dá)蛋白；（3）經(jīng)MALDI-TOF-MS分析和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，成功鑒定出44個(gè)蛋白；（4）被鑒定蛋白的MALDI-TOF/TOF分析結(jié)果與MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果一致；（5）被鑒定蛋白的RT-P

5、CR結(jié)果和Westernblot結(jié)果與2-DE的結(jié)果一致；（6）所鑒定的蛋白中有70％為細(xì)胞器蛋白，32％為膜蛋白。其中，細(xì)胞器蛋白主要定位在線粒體和細(xì)胞核上，而膜蛋白主要是質(zhì)膜、線粒體膜和其他膜蛋白；（7）所鑒定出的蛋白質(zhì)按其功能可以分為兩大類：與其它分子結(jié)合的蛋白（61％）和可以催化其他反應(yīng)的酶（68％）；（8）根據(jù)蛋白參與的生物學(xué)過(guò)程，可分為五類：第一類參與應(yīng)激反應(yīng)；第二類參與發(fā)育過(guò)程；第三類參與代謝反應(yīng)；第四類為其他類，這些蛋白