孕鼠暴露于炎癥、免疫刺激劑誘發(fā)子代高血壓機制研究：發(fā)病相關(guān)候選基因的篩選.pdf

1、原發(fā)性高血壓(essentialhypertension，EH)是最常見的心血管疾病，其并發(fā)癥是造成人類死亡的主要原因之一。探索EH的發(fā)病機制、尋找EH的防治方法有極其重要的意義。炎癥在心血管疾病發(fā)病中重要作用的認(rèn)識是近年來該領(lǐng)域最重要的進展之一。更為有趣的是，越來越多的臨床流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果提示高血壓在某些方面也與炎癥密切相關(guān)。我室近年研究發(fā)現(xiàn)，孕鼠暴露于炎癥刺激劑LPS或免疫刺激劑zymosan后，可導(dǎo)致仔鼠出生后血壓升高、體重增加；

2、近年發(fā)育生物學(xué)提出“成人慢性病的胎源性學(xué)說”，即成人一些慢性疾病如冠心病、Ⅱ型糖尿病、高血壓等的病因源于胚胎及嬰幼兒時期發(fā)育的可塑性，也就是在妊娠期間，始兒受到來自外界環(huán)境的刺激會對其發(fā)育產(chǎn)生影響，并可能對其成年后發(fā)生一些慢性疾病起重要作用，這一理論正與我們的研究發(fā)現(xiàn)相吻合。但究竟這種炎癥免疫刺激因素是通過那一些因子和途徑來引起胎兒發(fā)育上的改變導(dǎo)致仔鼠成年后發(fā)生血壓升高和體重增加，目前還未見相關(guān)報道。鑒于此，本研究擬在我室原有的研究工作

3、的基礎(chǔ)上，探討炎癥免疫刺激因素是如何影響胎兒的發(fā)育，研究炎癥免疫刺激孕鼠對胚胎全基因表達(dá)的影響，旨在探索仔鼠高血壓發(fā)病相關(guān)的候選基因，為進一步深入了解其分子機制和尋找有效干預(yù)措施提供新線索和理論依據(jù)。 方法： 1.SD孕鼠，在妊娠8、10、12天，分別腹腔注射0.79mg/kgLPS、8mg/kgzymosan為炎癥免疫刺激模型，對照組腹腔注射生理鹽水。 2.在最后一次注射后2小時鼠尾取血，及取最后一次注射后2h

4、、12h、24h及48h的羊水混合，用放免法檢測血清及羊水的TNF-α及IL-6水平。 3.實時熒光定量PCR分析胎盤、羊膜、羊水中細(xì)胞、胚胎及腹腔巨噬細(xì)胞中的TNF-α及IL-6mRNA水平。 4.Affymetrix的大鼠全基因組芯片研究炎癥免疫刺激模型與正常對照之間胚胎的基因表達(dá)譜的變化。 5.基因芯片數(shù)據(jù)采用GeneOnology分析生物學(xué)功能，采用GenMAPP2.1軟件分析信號通路。GO分析我們重點放

5、在分子功能分析上。 6.選擇了20個基因采用實時熒光定量PCR驗證基因芯片結(jié)果，并研究這些基因在胚胎不同時相點的表達(dá)變化情況。 結(jié)果與結(jié)論： 1.應(yīng)用孕鼠腹腔注射LPS、zymosan，血清TNF-α、IL-6水平較對照組明顯升高(P＜0.01)，說明在LPS和Zym組，母鼠均發(fā)生了炎癥免疫反應(yīng)：TN-αmRNA水平在巨噬細(xì)胞中表達(dá)最多，3h時是其它組織的上千倍；IL-6mRNA在巨噬細(xì)胞中表達(dá)最多，2h時是其它

6、細(xì)胞的幾十萬倍。說明炎性因子TNF-αIL-6主要來源于巨噬細(xì)胞一類炎性細(xì)胞。 2.在胚胎中TNF-αmRNA的量較低，而IL-6mRNA的量較其他幾種組織中高，并且炎癥刺激組在24h及48h兩個時相點要明顯高于對照組數(shù)十倍，提示IL-6與大鼠妊娠期注射炎癥免疫刺激劑引起仔代大鼠血壓升高有關(guān)；在羊膜、羊水及胎盤中LPS組明顯高于對照組，而Zym組則僅在胎盤中變化明顯，提示兩種炎癥免疫刺激劑作用路徑不盡相同，LPS可以通過影響羊膜

7、，羊水及胎盤的細(xì)胞因子變化而影響胚胎發(fā)育；zymosan則主要通過胎盤影響胚胎的發(fā)育。 3.用大鼠全基因芯片從28000個基因中發(fā)現(xiàn)孕鼠注射炎癥、免疫刺激劑后胚胎的差異表達(dá)基因：LPS組上調(diào)(Ratio≥2)的有183個、下調(diào)(Ratio≤0.5)的有270個；Zym組上調(diào)(Ratio≥2)的有144個、下調(diào)(Ratio≤0.5)的有417個。LPS組及Zym組中同向變化的基因，上調(diào)的有50個，其中功能已知的基因有10個(Tnn

8、t2，Argl，F(xiàn)gf8，Dusp9，Plekhf1，Soat1，F(xiàn)ubp1，Orc11，Hmga1，Nr2f6)；下調(diào)的有173個，其中功能已知的基因有85個。 4.GeneOntology功能檢索，差異表達(dá)基因數(shù)量較多的功能分類集中在結(jié)合分子、催化活性、轉(zhuǎn)運體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等幾個方面，涉及生長因子、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白和核轉(zhuǎn)錄因子，直接參與代謝的酶，肌鈣蛋白等。其中表達(dá)下調(diào)的基因比表達(dá)上調(diào)的多，這種胚胎期的基因表達(dá)下調(diào)可

9、能會影響仔鼠以后的發(fā)育。 5.GenMAPP信號通路的可視化分析，發(fā)現(xiàn)在DNA合成、RNA加工、細(xì)胞G1期到S期調(diào)控及翻譯因子方面，有差異表達(dá)的基因基本是都是上調(diào)，而且在LPS組及Zym組中呈高度的一致性；在心肌鈣調(diào)節(jié)、平滑肌收縮舒張通路及炎癥反應(yīng)通路中則下調(diào)的基因較多。 6.選擇了20個差異表達(dá)基因，采用實時熒光定量PCR技術(shù)對芯片結(jié)果進行驗證。在12h時與基因芯片數(shù)據(jù)一致的有13個、不一致的有4個，還有RGDl307

10、150、Bcllla及Tgfb2三個基因的Zym組與芯片結(jié)果一致。 7.各基因的mRNA含量變化中：Fgf8、Orcll在2h及12h時實驗組較對照組出現(xiàn)了上調(diào)，24h到48h逐漸降到對照組同一水平；Bcllla、Dusp9表現(xiàn)與上述相反；Nfib的mRNA水平在實驗組中各時相點均有不同程度的下調(diào)；Egfr、Gap43及Penkl的mRNA水平在2h時三個組相差不明顯，在12h到48h實驗組出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)；Agtr2在12

11、h時實驗組明顯低于對照組；Tgfb2在Zym組各時相點都有下調(diào)，而LPS組則沒有。 結(jié)合各基因功能分析：Fgf8、Orcll、Bcllla的表達(dá)變化可能與炎癥免疫刺激后胚胎的急性期調(diào)節(jié)有關(guān)；Nfia、Nfib及Gap43的表達(dá)下調(diào)可能與炎癥免疫刺激對胚胎腦發(fā)育的影響有關(guān)；Agtr2的表達(dá)下調(diào)可能會對仔鼠腎臟的發(fā)育產(chǎn)生一定的影響；Dusp9、Egfr、Ripx及Tgfb2等的表達(dá)變化可能與炎癥免疫刺激對胚胎細(xì)胞增殖分化的影響有關(guān)。