鼠疫菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)蛋白YscI-YscF相互作用的研究——以及蛋白質(zhì)分泌組新毒力因子的鑒定.pdf

1、本論文涉及兩個(gè)部分，即《鼠疫耶爾森氏菌III型分泌系統(tǒng)蛋白YscI-YscF相互作用的研究》和《鼠疫耶爾森氏菌蛋白質(zhì)組學(xué)分析及新毒力因子的鑒定。摘要及正文將分為兩個(gè)部分撰寫(xiě)。
　　摘要一鼠疫耶爾森氏菌III型分泌系統(tǒng)蛋白YscI-YscF相互作用的研究
　　III型分泌系統(tǒng)（Type III Secretion System,T3SS）是一種高度保守的毒力機(jī)制，廣泛分布于革蘭氏陰性菌中，能夠?qū)⑿?yīng)蛋白直接分泌到宿主細(xì)胞的細(xì)胞

2、質(zhì)中。該系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)類似于一支注射器，由兩部分組成，分別是橫跨于細(xì)菌內(nèi)膜、周質(zhì)及外膜的多環(huán)基座以及將毒力蛋白輸送到宿主細(xì)胞內(nèi)的中空針頭。鼠疫菌的T3SS由pCD1質(zhì)粒編碼而成，是由20余種蛋白質(zhì)構(gòu)成的一種超分子復(fù)合物，含有許多高度保守結(jié)構(gòu)，通過(guò)耗能將分泌性V抗原(LcrV)和耶爾森氏菌外膜蛋白(Yersinia outerproteins,Yops)由宿主細(xì)胞表面形成的小孔結(jié)構(gòu)注入到宿主細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到干擾細(xì)胞發(fā)揮其正常生理功能的目的。<

3、br>　　鼠疫菌的pCD1質(zhì)粒共編碼90多個(gè)基因，除去部分假基因和轉(zhuǎn)座酶相關(guān)基因后，共57個(gè)基因編碼T3SS相關(guān)蛋白。在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中，已通過(guò)酵母雙雜交陣列篩選技術(shù)篩選到57個(gè)蛋白之間的21個(gè)相互作用對(duì)，其中新發(fā)現(xiàn)12對(duì)，包括YscF-YscI。YscF的多聚體在細(xì)菌表面形成注射小體的針狀結(jié)構(gòu)，YscI是連接T3SS裝置分泌通道內(nèi)外環(huán)的蛋白。前期實(shí)驗(yàn)中已采用GST-pull down驗(yàn)證了YscI-YscF體外存在相互作用，并通過(guò)

4、構(gòu)建YscI截短突變體的方法確定介導(dǎo)二者體外相互作用的結(jié)構(gòu)域位于 YscI的第83-92位氨基酸。本研究中，將通過(guò)免疫共沉淀等方法繼續(xù)驗(yàn)證YscF-YscI的體內(nèi)相互作用關(guān)系，并探討其相互作用的生理功能。
　　首先，本研究利用λ-Red重組系統(tǒng)構(gòu)建鼠疫菌yscI基因突變株。再以阿拉伯糖誘導(dǎo)的pBAD24質(zhì)粒為載體構(gòu)建帶FLAG標(biāo)簽的yscI互補(bǔ)株及yscI截短突變體，并將成功構(gòu)建的新載體導(dǎo)入yscI突變株，分別為△yscI-FLA

5、G-YscI、△yscI-C△73-85、△yscI-C△83-92、△yscI-C△93-102和△yscI-C△93-102。接下來(lái)，運(yùn)用免疫共沉淀（Co-IP）的方法在FLAG樹(shù)脂結(jié)合下來(lái)的樣品中檢測(cè)到了YscF蛋白，驗(yàn)證了YscI-YscF在體內(nèi)存在相互作用；并使用同樣的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)不同突變菌株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果，對(duì)△yscI-C△83-92、△yscI-C△93-102菌株的Co-IP實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)LAG樹(shù)脂結(jié)合下來(lái)的樣品中未檢測(cè)到Y(jié)s

6、cF蛋白。以上結(jié)果說(shuō)明，影響YscI-YscF體內(nèi)相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域位于YscI蛋白C末端的第83-102位氨基酸。
　　本研究分別運(yùn)用YscF聚合體交聯(lián)的方法檢測(cè)上述構(gòu)建的yscI互補(bǔ)株以及yscI截短突變株在細(xì)菌表面組裝YscF針狀結(jié)構(gòu)的能力；運(yùn)用WB免疫印跡的方法檢測(cè)其表達(dá)及分泌YscI、YscF以及效應(yīng)蛋白YopN、YopM、YopE、YopK和LcrV的能力。結(jié)果表明：鼠疫菌yscI互補(bǔ)株和yscI截短突變株均可以在菌

7、體內(nèi)表達(dá)YscI和YscF，但不能分泌到上清中；在△yscI、△yscF和△yscI-C△83-92的菌體表面未檢測(cè)到 YscF多聚體，在其分泌上清中也未檢測(cè)到效應(yīng)蛋白；在△yscI-C△93-102細(xì)菌表面能檢測(cè)到Y(jié)scF多聚體，但該菌株不能夠正常分泌效應(yīng)蛋白。以上結(jié)果闡明，當(dāng)YscI的第83-92位氨基酸缺失時(shí)，該突變株不能形成針狀結(jié)構(gòu)且無(wú)法分泌效應(yīng)蛋白；當(dāng)?shù)?3-102位氨基酸缺失時(shí)，該菌株組裝YscF針狀結(jié)構(gòu)的能力受到一定影響，

8、但其分泌效應(yīng)蛋白的功能并未完全喪失。
　　針對(duì)YscI的83-92位氨基酸區(qū)域進(jìn)行序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)YscI的第85、86、88和92位氨基酸與YscF同源性高。因此，本研究構(gòu)建了C末端帶有FLAG標(biāo)簽的yscI點(diǎn)突變體，并導(dǎo)入yscI突變株，分別為△yscI-CW85A、△yscI-CS86A、△yscI-CI88A以及△yscI-CI92A。利用免疫共沉淀方法檢測(cè)與YscF體內(nèi)相互作用，結(jié)果在對(duì)△yscI-CW85A、△yscI

9、-CS86A菌株的Co-IP實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)LAG樹(shù)脂結(jié)合下來(lái)的樣品中未檢測(cè)到Y(jié)scF蛋白。利用GST-pull down方法檢測(cè)與YscF體外相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YscI-W85A或YscI-S86A與YscF未發(fā)生結(jié)合。以上結(jié)果表明，YscI第85或86位氨基酸的缺失，同時(shí)影響了YscI與YscF之間體內(nèi)外的相互作用。
　　本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)無(wú)法在△yscI-CW85A和△yscI-CS86A的細(xì)菌表面檢測(cè)到Y(jié)scF多聚體，也無(wú)法在其上

10、清中檢測(cè)到效應(yīng)蛋白。這一結(jié)果闡明，YscI的第85或86位氨基酸缺失導(dǎo)致YscI-YscF失去相互作用，并且該突變株也不能形成針狀結(jié)構(gòu)和分泌效應(yīng)蛋白。
　　本研究還通過(guò)觀察細(xì)菌感染Hela細(xì)胞后形態(tài)的變化，以及用無(wú)標(biāo)記細(xì)胞實(shí)時(shí)定量分析法研究鼠疫菌yscI截短及點(diǎn)突變株的細(xì)胞毒性。在顯微鏡下，我們看到野生株鼠疫菌感染3h后的Hela細(xì)胞明顯變圓，表明效應(yīng)蛋白破壞細(xì)胞骨架；而△yscI、△yscF、△yscI-C△83-92、△ysc

11、I-C△93-102、△yscI-CW85A以及△yscI-CS86A感染的Hela細(xì)胞形態(tài)更接近于正常細(xì)胞，這說(shuō)明以上菌株對(duì)Hela細(xì)胞的毒力作用已大幅度減弱。本研究還利用免疫印跡的方法檢測(cè)了yscI截短及點(diǎn)突變株感染 Hela細(xì)胞后向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)效應(yīng)蛋白的能力，結(jié)果表明對(duì)HeLa細(xì)胞毒力明顯減弱的幾株突變株同樣不能將效應(yīng)蛋白LcrV、YopM和YopE轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞胞漿中。
　　摘要二鼠疫耶爾森氏菌蛋白質(zhì)組學(xué)分析及新毒力因子的鑒定

12、r>　　鼠疫（plague）是由鼠疫耶爾森氏菌引起的烈性傳染病，主要由節(jié)肢動(dòng)物跳蚤通過(guò)叮咬傳染給宿主嚙齒類動(dòng)物，并有可能傳播給人導(dǎo)致腺鼠疫、肺炎鼠疫和敗血癥等的發(fā)生，給人們?cè)斐闪司薮蟮纳拓?cái)產(chǎn)損失。本研究利用蛋白質(zhì)組技術(shù)，在鼠疫菌全基因組測(cè)序已完成的基礎(chǔ)上，對(duì)鼠疫菌201株在兩種不同的生理?xiàng)l件下，即26℃含鈣（模擬跳蚤體內(nèi)環(huán)境）和37℃低鈣（模擬哺乳動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境）的蛋白質(zhì)組展開(kāi)研究，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)鼠疫菌致病的新的關(guān)鍵毒力因子，為防治鼠疫

13、菌和新疫苗研究提供更多方法和靶標(biāo)。
　　首先，本研究制備出鼠疫菌在26℃含鈣和37℃低鈣培養(yǎng)條件下的分泌蛋白質(zhì)組和菌體蛋白質(zhì)組。該過(guò)程主要使用 TMH人工合成培養(yǎng)基培養(yǎng)鼠疫菌，在兩種條件下培養(yǎng)8h，然后使用超濾法進(jìn)行上清蛋白的濃縮，菌體用含尿素裂解液裂解，并用BCA試劑盒測(cè)量菌體蛋白和上清蛋白的濃度。此外，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)鼠疫菌T3SS不同蛋白質(zhì)組分的動(dòng)態(tài)監(jiān)控，在8h分泌時(shí)間內(nèi)選擇了一系列時(shí)間點(diǎn)作為分泌時(shí)間，分別為，80min、160m

14、in、240min、320min、400min和480min，制備出不同時(shí)間序列的分泌蛋白質(zhì)組及菌體蛋白質(zhì)組樣品。
　　在本研究中，我們通過(guò)同量異序化學(xué)標(biāo)簽（Tandem Mass Tags，TMT）法對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。TMT是通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)定量鑒定不同樣品中蛋白質(zhì)的有效工具。這些小化學(xué)分子標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)類似，以共價(jià)結(jié)合賴氨酸的氨基末端的方式標(biāo)記蛋白樣品中的多肽。在質(zhì)譜分析中，每種分子量的TMT標(biāo)簽都能生成一個(gè)特殊的離子圖譜，通過(guò)

15、比較不同標(biāo)簽標(biāo)記的離子的相對(duì)豐度實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白的相對(duì)定量。我們共檢測(cè)到2141個(gè)鼠疫菌蛋白質(zhì)，占基因組預(yù)測(cè)CDS的52.2％。其中1081個(gè)蛋白質(zhì)同時(shí)出現(xiàn)在分泌和菌體蛋白質(zhì)組中。將Score≥5和Unique Peptide≥2作為定義潛在分泌蛋白的標(biāo)準(zhǔn)，共在培養(yǎng)上清中檢測(cè)到767個(gè)分泌蛋白，其中Yp-2058、Yp-3657和Yp_3415-Yp_3418幾種未知功能的蛋白在37℃表達(dá)上調(diào)，可能與鼠疫菌在宿主動(dòng)物中的毒力密切相關(guān)。

16、>　　在研究T3SS的分泌蛋白動(dòng)態(tài)變化實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)不同時(shí)間序列的蛋白質(zhì)組樣品的質(zhì)譜結(jié)果分析，未觀察到鼠疫菌T3SS蛋白組分隨時(shí)間的蛋白特異性變化規(guī)律，推測(cè)可能是由于最短分泌時(shí)間80min時(shí)，分泌蛋白質(zhì)種類已基本趨于穩(wěn)定。本研究建立了一種新方法分辨哪些蛋白是T3SS的分泌蛋白，即將上清/菌體的PSM值大于1作為分泌蛋白的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)現(xiàn)根據(jù)上清/菌體的 PSM值大于1為標(biāo)準(zhǔn)判斷鑒定出的 T3SS分泌底物的蛋白，均是文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道的分泌蛋白；

17、而那些比值小于1的蛋白為T(mén)3SS結(jié)構(gòu)蛋白、ATP酶以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。
　　在分子實(shí)驗(yàn)部分中，針對(duì)篩選出的高表達(dá)分泌蛋白質(zhì)Yp_3416、Yp_3417、Yp_3418、Yp_2058和Yp_3657進(jìn)行毒力及功能的驗(yàn)證。本研究采用基于pDS132自殺載體的方法構(gòu)建yp_3416、yp_3418和yp_3416-3418的無(wú)痕突變株。分別以尾靜脈感染途徑和滴鼻感染途徑對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，繪制出生存曲線。結(jié)果表明，經(jīng)尾靜脈感染后，鼠疫菌

18、野生株與yp_3416突變株，yp_3416-3418突變株的生存曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與yp_3418突變株無(wú)差異；滴鼻感染結(jié)果中，野生株與以上3株突變株的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究還構(gòu)建出yp_3416、yp_3417、yp_3418、yp_2058和yp_3657的β-內(nèi)酰胺酶（TEM）報(bào)告質(zhì)粒，導(dǎo)入鼠疫菌野生株后，分別感染 Hela細(xì)胞。當(dāng)靶蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)，與靶蛋白融合表達(dá)的β-內(nèi)酰胺酶可降解細(xì)胞內(nèi)CCF2-AM染料分子，在