卵巢癌相關分泌-釋放蛋白質組的建立.pdf

1、第一部分:卵巢癌相關分泌/釋放蛋白質組的建立
　　 卵巢癌是惡性程度最高的婦科腫瘤,其死亡-發(fā)病率(death-to—incidence ratio)在女性常見腫瘤中僅低于肺癌。早期卵巢癌患者的五年生存率遠高于晚期卵巢癌患者,然而大多數(shù)病例在被診斷為卵巢癌時便已進展到晚期,足見早期診斷的必要性。外周血腫瘤相關蛋白標志物具有輔助診斷、判斷預后及指導治療的臨床應用價值。目前,尚缺乏有效的用于卵巢癌早期診斷的外周血蛋白標志物。

2、　　 目的:
　　 本項研究旨在建立卵巢癌相關分泌/釋放蛋白質組,經(jīng)篩選和驗證獲得外周血中卵巢癌相關蛋白標志物,以期構建用于卵巢癌臨床診斷的候選蛋白聯(lián)合檢測模型。
　　 方法:
　　 以實驗室前期開創(chuàng)的無血清原代器官培養(yǎng)模型為基礎,本項研究對6例卵巢癌患者腫瘤組織及其對應正常卵巢組織進行體外無血清原代培養(yǎng),然后收集各自的無血清條件培養(yǎng)基,經(jīng)SDS—PAGE分離后,采用液相色譜和OSTAR XL電噴霧串聯(lián)質譜儀(

3、或SYNAPT HD離子遷移質譜儀)鑒定培養(yǎng)基中的蛋白全譜。繼而采用GOFFA、PANTHER和MetaCore軟件對鑒定出的蛋白數(shù)據(jù)進行GO富集分析和分子網(wǎng)絡分析。隨后,從數(shù)據(jù)庫中挑選候選蛋白,主要采用雙抗體夾心ELISA技術檢測候選蛋白在不同人群血漿中的蛋白水平,包括59例卵巢癌患者、51例婦科良性疾患者和58例健康者。最后采用二分類邏輯回歸法構建蛋白聯(lián)合檢測模型。
　　 結果:
　　 通過質譜鑒定共獲得1129個蛋

4、白,構建了卵巢癌相關分泌/釋放蛋白質組。GO分析顯示分泌蛋白和細胞膜蛋白占總蛋白的比例達到38.3％,總蛋白顯著富集于“細胞外基質蛋白介導的信號轉導”、“蛋白裂解和折疊”、“糖酵解”、“細胞結構”和免疫相關反應等生物學過程。隨后,從該數(shù)據(jù)庫中挑選了六個蛋白(NID1、TIMP2、VCAN、B2M、TF和CA125)在血漿樣品中進行驗證。結果顯示,所有被測蛋白的血漿水平在卵巢癌患者和健康者之間均有顯著差異(P＜0.05),NID1、VCA

5、N和CA125的血漿水平在良性疾患者和健康者之間存在顯著差異(P＜0.001),而B2M、TF和CA125的血漿水平在卵巢癌患者和良性疾患者之間存在顯著差異(P＜0.001)。以此為基礎,我們初步構建了蛋白聯(lián)合檢測模型。其中,3-蛋白標志譜(包括NID1、TIMP2和CA125)用于區(qū)分卵巢癌患者和健康者,其準確率、敏感性和特異性分別為98.3％、96.6％和100.0％。5-蛋白標志譜(包括NID1、TIMP2、B2M、TF和CA12

6、5)用于區(qū)分卵巢癌患者和非卵巢癌患者,其準確率、敏感性和特異性分別為89.9％、81.4％和94.5％。小樣本的研究資料顯示,上述3-蛋白標志譜和5-蛋白標志譜在診斷卵巢癌時的檢測效能均優(yōu)于CA125單一標志。
　　 結論:
　　 本項研究所建立的卵巢癌相關分泌/釋放蛋白數(shù)據(jù)庫為體液中卵巢癌相關標志蛋白的后續(xù)研究提供了可靠的資源,從中可深入挖掘潛在的卵巢癌標志物；而初步構建的聯(lián)合檢測模型作為輔助卵巢癌臨床診斷的候選模型,

7、將進一步在獨立樣本中進行驗證。
　　 第二部分:ENO1在非小細胞肺癌中的功能研究
　　 在本實驗室前期肺癌相關分泌/釋放蛋白質組的工作中,無標記定量分析結果顯示,有六個糖酵解代謝酶的蛋白水平在肺癌患者腫瘤組織無血清條件培養(yǎng)基中顯著升高,烯醇化酶1(α-enolase,ENO1)是其中之一。進一步的驗證則發(fā)現(xiàn),它在非小細胞肺癌患者腫瘤組織和血漿中的蛋白水平均顯著升高。目前,尚未見ENO1在肺癌中功能研究的報道。
　

8、　 目的:
　　 本項研究旨在初步探討ENO1在非小細胞肺癌細胞中的生物學功能。
　　 方法:
　　 采用Western blot方法檢測人非小細胞肺癌細胞系(A549、H520、H1299、PG)、人永生化支氣管上皮細胞系(M-BE和Y-BE)和小鼠胚胎成纖維細胞系(NIH/3T3)中ENO1蛋白表達水平。構建穩(wěn)定過表達和瞬時下調ENO1蛋白的肺腺癌A549細胞模型和肺磷癌H520細胞模型,采用CCK-8細胞

9、增殖實驗和平板集落形成實驗檢測ENO1對A549細胞和H520細胞增殖能力的影響,隨后借助劃痕實驗研究ENO1對A549細胞側向運動能力的影響。采用Western blot方法檢測穩(wěn)定過表達和瞬時下調ENO1蛋白的A549細胞中細胞周期素Cyclin B1和Cyclin D1的水平。
　　 結果:
　　 ENO1蛋白在NIH/3T3細胞系中表達量最低,在非小細胞肺癌細胞系中的表達量最高。它在不同階段的M-BE細胞系的表達

10、水平保持恒定,但在Y-BE細胞系中代和晚代的水平明顯高于早代。穩(wěn)定過表達ENO1蛋白可以促進A549細胞增殖和集落形成；瞬時下調ENO1蛋白可以減弱A549細胞增殖和集落形成。另外,ENO1并不能影響H520細胞增殖和集落形成。無論是穩(wěn)定過表達還是瞬時下調ENO1蛋白都不改變A549細胞中Cyclin B1和Cyclin D1的表達水平。
　　 結論:
　　 ENO1可能通過調控細胞周期以外的途徑來促進A549細胞增殖。