卵巢癌相關(guān)分泌-釋放蛋白質(zhì)組的建立.pdf

1、第一部分:卵巢癌相關(guān)分泌/釋放蛋白質(zhì)組的建立
　　 卵巢癌是惡性程度最高的婦科腫瘤,其死亡-發(fā)病率(death-to—incidence ratio)在女性常見(jiàn)腫瘤中僅低于肺癌。早期卵巢癌患者的五年生存率遠(yuǎn)高于晚期卵巢癌患者,然而大多數(shù)病例在被診斷為卵巢癌時(shí)便已進(jìn)展到晚期,足見(jiàn)早期診斷的必要性。外周血腫瘤相關(guān)蛋白標(biāo)志物具有輔助診斷、判斷預(yù)后及指導(dǎo)治療的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前,尚缺乏有效的用于卵巢癌早期診斷的外周血蛋白標(biāo)志物。

2、　　 目的:
　　 本項(xiàng)研究旨在建立卵巢癌相關(guān)分泌/釋放蛋白質(zhì)組,經(jīng)篩選和驗(yàn)證獲得外周血中卵巢癌相關(guān)蛋白標(biāo)志物,以期構(gòu)建用于卵巢癌臨床診斷的候選蛋白聯(lián)合檢測(cè)模型。
　　 方法:
　　 以實(shí)驗(yàn)室前期開(kāi)創(chuàng)的無(wú)血清原代器官培養(yǎng)模型為基礎(chǔ),本項(xiàng)研究對(duì)6例卵巢癌患者腫瘤組織及其對(duì)應(yīng)正常卵巢組織進(jìn)行體外無(wú)血清原代培養(yǎng),然后收集各自的無(wú)血清條件培養(yǎng)基,經(jīng)SDS—PAGE分離后,采用液相色譜和OSTAR XL電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀(

3、或SYNAPT HD離子遷移質(zhì)譜儀)鑒定培養(yǎng)基中的蛋白全譜。繼而采用GOFFA、PANTHER和MetaCore軟件對(duì)鑒定出的蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行GO富集分析和分子網(wǎng)絡(luò)分析。隨后,從數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選候選蛋白,主要采用雙抗體夾心ELISA技術(shù)檢測(cè)候選蛋白在不同人群血漿中的蛋白水平,包括59例卵巢癌患者、51例婦科良性疾患者和58例健康者。最后采用二分類(lèi)邏輯回歸法構(gòu)建蛋白聯(lián)合檢測(cè)模型。
　　 結(jié)果:
　　 通過(guò)質(zhì)譜鑒定共獲得1129個(gè)蛋

4、白,構(gòu)建了卵巢癌相關(guān)分泌/釋放蛋白質(zhì)組。GO分析顯示分泌蛋白和細(xì)胞膜蛋白占總蛋白的比例達(dá)到38.3％,總蛋白顯著富集于“細(xì)胞外基質(zhì)蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”、“蛋白裂解和折疊”、“糖酵解”、“細(xì)胞結(jié)構(gòu)”和免疫相關(guān)反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。隨后,從該數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選了六個(gè)蛋白(NID1、TIMP2、VCAN、B2M、TF和CA125)在血漿樣品中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,所有被測(cè)蛋白的血漿水平在卵巢癌患者和健康者之間均有顯著差異(P＜0.05),NID1、VCA

5、N和CA125的血漿水平在良性疾患者和健康者之間存在顯著差異(P＜0.001),而B(niǎo)2M、TF和CA125的血漿水平在卵巢癌患者和良性疾患者之間存在顯著差異(P＜0.001)。以此為基礎(chǔ),我們初步構(gòu)建了蛋白聯(lián)合檢測(cè)模型。其中,3-蛋白標(biāo)志譜(包括NID1、TIMP2和CA125)用于區(qū)分卵巢癌患者和健康者,其準(zhǔn)確率、敏感性和特異性分別為98.3％、96.6％和100.0％。5-蛋白標(biāo)志譜(包括NID1、TIMP2、B2M、TF和CA12

6、5)用于區(qū)分卵巢癌患者和非卵巢癌患者,其準(zhǔn)確率、敏感性和特異性分別為89.9％、81.4％和94.5％。小樣本的研究資料顯示,上述3-蛋白標(biāo)志譜和5-蛋白標(biāo)志譜在診斷卵巢癌時(shí)的檢測(cè)效能均優(yōu)于CA125單一標(biāo)志。
　　 結(jié)論:
　　 本項(xiàng)研究所建立的卵巢癌相關(guān)分泌/釋放蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)為體液中卵巢癌相關(guān)標(biāo)志蛋白的后續(xù)研究提供了可靠的資源,從中可深入挖掘潛在的卵巢癌標(biāo)志物；而初步構(gòu)建的聯(lián)合檢測(cè)模型作為輔助卵巢癌臨床診斷的候選模型,

7、將進(jìn)一步在獨(dú)立樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 第二部分:ENO1在非小細(xì)胞肺癌中的功能研究
　　 在本實(shí)驗(yàn)室前期肺癌相關(guān)分泌/釋放蛋白質(zhì)組的工作中,無(wú)標(biāo)記定量分析結(jié)果顯示,有六個(gè)糖酵解代謝酶的蛋白水平在肺癌患者腫瘤組織無(wú)血清條件培養(yǎng)基中顯著升高,烯醇化酶1(α-enolase,ENO1)是其中之一。進(jìn)一步的驗(yàn)證則發(fā)現(xiàn),它在非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織和血漿中的蛋白水平均顯著升高。目前,尚未見(jiàn)ENO1在肺癌中功能研究的報(bào)道。
　

8、　 目的:
　　 本項(xiàng)研究旨在初步探討ENO1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。
　　 方法:
　　 采用Western blot方法檢測(cè)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(A549、H520、H1299、PG)、人永生化支氣管上皮細(xì)胞系(M-BE和Y-BE)和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系(NIH/3T3)中ENO1蛋白表達(dá)水平。構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和瞬時(shí)下調(diào)ENO1蛋白的肺腺癌A549細(xì)胞模型和肺磷癌H520細(xì)胞模型,采用CCK-8細(xì)胞

9、增殖實(shí)驗(yàn)和平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ENO1對(duì)A549細(xì)胞和H520細(xì)胞增殖能力的影響,隨后借助劃痕實(shí)驗(yàn)研究ENO1對(duì)A549細(xì)胞側(cè)向運(yùn)動(dòng)能力的影響。采用Western blot方法檢測(cè)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和瞬時(shí)下調(diào)ENO1蛋白的A549細(xì)胞中細(xì)胞周期素Cyclin B1和Cyclin D1的水平。
　　 結(jié)果:
　　 ENO1蛋白在NIH/3T3細(xì)胞系中表達(dá)量最低,在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)量最高。它在不同階段的M-BE細(xì)胞系的表達(dá)

10、水平保持恒定,但在Y-BE細(xì)胞系中代和晚代的水平明顯高于早代。穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ENO1蛋白可以促進(jìn)A549細(xì)胞增殖和集落形成；瞬時(shí)下調(diào)ENO1蛋白可以減弱A549細(xì)胞增殖和集落形成。另外,ENO1并不能影響H520細(xì)胞增殖和集落形成。無(wú)論是穩(wěn)定過(guò)表達(dá)還是瞬時(shí)下調(diào)ENO1蛋白都不改變A549細(xì)胞中Cyclin B1和Cyclin D1的表達(dá)水平。
　　 結(jié)論:
　　 ENO1可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期以外的途徑來(lái)促進(jìn)A549細(xì)胞增殖。