獨一味膠囊中主要有效成分含量測定及其對馬西替坦在大鼠體內(nèi)外代謝的影響.pdf

1、第一部分 UPLC-MS/MS法檢測獨一味膠囊中6種主要成分含量及其在大鼠體內(nèi)藥代動力學研究
　　目的：建立超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定獨一味膠囊口服和靜脈給藥后大鼠體內(nèi)8-O-乙酰山梔苷甲酯、山梔苷甲酯、胡麻屬苷、類葉升麻苷、木犀草素和木犀草苷等6種獨一味活性成分的濃度。
　　方法：稱取適量獨一味膠囊中粉末經(jīng)超聲過濾處理分別以灌胃和舌下靜脈方式對SD大鼠給藥，按設立的時間點對SD大鼠尾靜脈取血約0.3mL，用乙腈沉淀蛋白法

2、處理血漿，使用ACQUITY UPLC BEH C18(50mm×2.1 mm,1.7μm)色譜柱；流動相為乙腈-0.1％甲酸水，采用梯度洗脫方法，流速為0.4 mL/min；使用正離子多離子反應監(jiān)測（MRM）掃描，內(nèi)標為地西泮。
　　結果：血漿中六種成分在濃度范圍內(nèi)均顯示良好的線性( r>0.99)，最低定量限的范圍為0.1-2.5 ng/mL。方法日內(nèi)精密度（RSD）的范圍為1.20%-8.84%，日間精密度在2.40%-8.

3、05%的范圍內(nèi)；提取回收率均大于73%；各成分基質(zhì)效應在(92.15±5.58)%和(104±5.65)%之間，基質(zhì)對檢測不造成影響；六種成分高、中、低濃度的短期，長期及反復凍融穩(wěn)定性RSD均小于15%，表明樣品中六種化合物在24h內(nèi)，在-80℃條件及反復凍融情況下都有較好的穩(wěn)定性。
　　結論：我們的研究結果證明，超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法操作簡便、快捷，靈敏度高，能夠快速有效地對大鼠血漿中8-O-乙酰山梔苷甲酯、山梔苷甲酯、胡麻屬苷、

4、類葉升麻苷、木犀草素和木犀草苷等6種活性成分濃度進行測定并成功應用于藥代動力學研究。
　　第二部分獨一味中六種有效成分對馬西替坦在大鼠體內(nèi)外代謝的影響
　　目的：建立UPLC-MS/MS高效準確檢測生物樣品中馬西替坦及其代謝產(chǎn)物ACT-132577的方法。研究馬西替坦和藏藥獨一味合用時獨一味對馬西替坦在大鼠體內(nèi)代謝的影響。建立馬西替坦體外孵育體系并摸索其具體孵育條件，并在此體系下研究獨一味中6種有效成分8-O-乙酰山梔苷甲酯

5、、山梔苷甲酯、胡麻屬苷、類葉升麻苷、木犀草素和木犀草苷分別對馬西替坦在大鼠體外代謝的影響。方法：1）以ACQUITY UPLC BEH C18柱(50mm×2.1 mm,1.7μm)色譜柱；流動相為乙腈-0.1%甲酸水，梯度洗脫；使用正離子多離子反應監(jiān)測（MRM）掃描的UPLC-MS/MS方法測定底物馬西替坦及其代謝物ACT-132577的濃度。
　　2）12只SD雄性大鼠隨機分成兩組，以單獨服用馬西替坦為對照組，共同服用馬西替坦

6、和獨一味為實驗組，給藥后0.083，0.25，0.5，1，1.5，2，4，6，8，12和24 h尾靜脈采血，離心取血漿經(jīng)乙腈蛋白沉淀處理，通過UPLC-MS/MS法檢測大鼠血漿中馬西替坦和代謝產(chǎn)物ACT-132577的血藥濃度，應用軟件DAS進行藥動學分析及SPSS17.0進行統(tǒng)計學分析。
　　3）經(jīng)摸索確立大鼠肝微粒體代謝馬西替坦的體外孵育體系的條件，體外孵育體系共200μL，其中包括大鼠微粒體4μL，1-25μM的馬西替坦溶液

7、以及100mM Tris-HCl緩沖液（PH=7.4），37℃水浴中預孵育5min，加入10μL的NADPH啟動反應進行，孵育時間為20min。樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白處理，用上述UPLC-MS/MS方法同時測定馬西替坦和代謝產(chǎn)物ACT-132577的濃度，計算相應的酶動力學參數(shù)并作圖。
　　4）在上述200μL體外孵育體系中分別加入濃度梯度為0.001~100 mM的8-O-乙酰山梔苷甲酯、山梔苷甲酯、胡麻屬苷、類葉升麻苷、木犀草素或

8、木犀草苷，于37℃水浴中孵育20 min。終止反應后，樣品經(jīng)處理，用UPLC-MS/MS法測定馬西替坦和代謝產(chǎn)物ACT-132577，并計算其在各個不同微粒體孵育體系中的IC50值。
　　結果：1）建立了靈敏可靠的檢測血漿中馬西替坦及其主要活性代謝產(chǎn)物ACT-132577的UPLC-MS/MS方法。血漿中兩種成分在濃度范圍內(nèi)均顯示良好的線性( r>0.99)，最低定量限的范圍為10ng/mL。方法日內(nèi)精密度（RSD）的范圍為2.9

9、%-8.8%，日間精密度在5.9%-11.8%的范圍內(nèi)；提取回收率均大于80.2%；基質(zhì)效應在92.98-102.68%之間，基質(zhì)對檢測不造成影響；樣品穩(wěn)定性良好。
　　2）獨一味對馬西替坦在大鼠體內(nèi)代謝的影響實驗顯示與對照組相比，實驗組馬西替坦AUC0→∞和 AUC0→t顯著增大，約為對照組的1.5倍，而其代謝產(chǎn)物AUC0→∞和 AUC0→t相應減小(*P＜0.05)。VZ和CL顯著減小，約為對照組的1/2。
　　3）在確

10、立的大鼠肝微粒體代謝馬西替坦的體外孵育體系中，木犀草素在0.001~100μM的濃度范圍對馬西替坦表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。在體外大鼠肝微粒體體系中，木犀草素IC50為6.287μM。而在體外大鼠肝微粒體體系中未發(fā)現(xiàn)獨一味其它5種活性成分對馬西替坦代謝有明顯影響。
　　結論：
　　結合體內(nèi)外實驗結果，獨一味中木犀草素在一定濃度范圍內(nèi)會影響治療PAH藥馬西替坦的藥代動力學過程。因此，在馬西替坦在與獨一味合用時，應該注意馬西替坦