弓形蟲RNA結合蛋白Puf2的克隆表達、亞細胞定位及功能初探.pdf

1、背景:
　　剛地弓形蟲是一種專性細胞內寄生的單細胞原蟲，寄生于除紅細胞外的幾乎所有有核細胞內，可侵犯腦、淋巴結、眼、肝、心、肺、肌肉等組織器官，從而引起人獸共患的寄生蟲病，如弓形蟲腦炎，弓形蟲眼病等。在宿主免疫功能正常的情況下，入侵的弓形蟲速殖子通常轉化為感染能力較弱的緩殖子，形成包囊，寄生在宿主的腦、肌肉和視網(wǎng)膜等細胞中，使宿主處于隱性感染狀態(tài);當宿主患有艾滋病，惡性腫瘤等免疫功能受損或低下時，宿主體內的包囊中的緩殖子能活化轉變

2、為速殖子，迅速增殖，引起組織破壞，形成局部炎癥，如不及時治療，可導致宿主的死亡。因此速緩殖子之間的相互轉換是剛地弓形蟲致病的中心環(huán)節(jié)。而弓形蟲急、慢性感染的生物學基礎及機制，不論是物理學或生物學上的原因，其本質上都是在轉錄、轉錄后加工、翻譯或者翻譯后的修飾水平上發(fā)生的改變，導致了不同蛋白的期特異性表達。在生物體內正確的基因表達需要正確的時間，合適的數(shù)量以及在細胞內正確的位置等各個方面的集體作用，而如此緊密的調控不僅需要轉錄調控，同時也需

3、要多層次的轉錄后控制。與轉錄調控相比，基因表達的翻譯調控可以使細胞更迅速地對外部刺激作出響應。如近年研究火熱的一類RNA結合蛋白-Puf蛋白，其中多項研究表明，從酵母到人類，Puf蛋白與靶RNA進行特異性結合，誘導其發(fā)生降解或者是抑制其降解從而使生物體內發(fā)生相應的變化。Puf蛋白是以黑腹果蠅的Pumilio（Pum）蛋白及秀麗隱桿線蟲的Fem-3結合因子蛋白(FBF)進行命名的RNA結合蛋白，通過結合靶mRNA3’端非轉錄區(qū)(3'UTR

4、)的特定核苷酸序列，通常稱為Puf-結合序列(Puf binding element，PBE)來行使翻譯調控。Puf蛋白的顯著特征是具有一個高度保守的核心RNA結合結構域，簡稱為Puf域(Puf domain)，通常由8個連續(xù)的相似的Puf-RNA結構域，每個結構域包含36～40個氨基酸，形成3個α-螺旋結構，第一個和第八個結構域兩端分別連接著一個不完全的結構域。據(jù)多項研究表明，在布魯氏錐蟲這種原蟲中，Puf家族蛋白中的Puf1蛋白是影

5、響蟲體活力的一個必不可少的因素，其中Puf蛋白可以調控多種真核細胞的多種過程，如干細胞的維持，細胞器的生物合成，卵子的發(fā)生，神經(jīng)元功能和記憶的形成過程等。值得注意的是，Muller等在瘧原蟲Puf2基因的研究中，敲除惡性瘧原蟲和伯氏瘧原蟲的Puf2基因后可促進配子體分化并提高雄/雌配子體比例，而伯氏瘧原蟲的Puf2基因敲除后，存在于蚊子唾液腺內的子孢子提早轉化成類似于肝內早期階段的形態(tài)。上述研究揭示了Puf2蛋白在頂復門原蟲中起到調節(jié)m

6、RNA翻譯的一個分子作用機制。
　　同樣為頂復門原蟲的剛地弓形蟲中，是否存在Puf2蛋白及其在剛地弓形蟲速緩殖子轉化的過程中是否發(fā)揮了一定的作用？本文從分子生物學水平來對TgPuf2蛋白進行特征分析，并探討其在弓形蟲速緩殖子中的表達情況，細胞定位，及對其的RNA結合能力進行初探。
　　目的:
　　1、檢測在RH株剛地弓形蟲中是否存在Puf2;
　　2、觀察Puf2蛋白在RH株剛地弓形蟲速緩殖子的表達情況;

7、　　3、觀察Puf2蛋白在RH株剛地弓形蟲速殖子的亞細胞定位情況;
　　4、TgPuf2RNA結合功能初探。
　　方法:
　　1、為了檢測在RH株剛地弓形蟲中是否存在Puf2，根據(jù)Toxo DB數(shù)據(jù)庫中GT1株剛地弓形蟲Puf2蟲株基因序列(TGGT1_122890)設計特異性引物P1，以RH株cDNA為模板進行擴增。
　　2、通過堿性培養(yǎng)基(pH8.2)誘導形成緩殖子，采用RT-qPCR方法檢測TgPuf2在速

8、殖子和緩殖子兩個時期的mRNA水平差異。
　　3、采用同源重組的方法在內源性TgPuf2蛋白的C端融合表達3×HA標簽，構建TgPuf2-HA的轉基因弓形蟲蟲株。以RH蟲株的基因組DNA為模板擴增Puf23'末端約1.5 kb的同源序列，特異性引物為P2擴增產(chǎn)物插入pLIC-HAx3-DHFRTs內源性標記載體，使TgPuf2編碼序列與標簽蛋白的編碼區(qū)可融合表達。
　　pLIC-Puf2HAx3-DHFRTs質粒通過測序鑒定

9、正確無誤后轉染
　　RHΔKu80ΔHXGPRT蟲株，在HFF宿主細胞生長24小時后，用1.0μM乙胺嘧啶進行藥物篩選。待抗藥蟲子長起來后傳代兩次，然后用有限制稀釋法篩選單克隆蟲株，最后通過Western Blot和免疫熒光實驗(Immunofluorescence assay，IFA)進行驗證。
　　4、以RH株的cDNA為模版，用特異性引物P3擴增TgPuf2的Puf2結構域插入pET32a表達質粒的BamHⅠ和Hind

10、Ⅲ多克隆位點之間。TgPuf2的Puf結構域的C端融合表達組氨酸(His)，IPTG誘導表達后的菌體蛋白用抗His的抗體進行WesternBlot驗證。通過親和純化獲得His融合表達的重組蛋白——rTgPuf2-His。
　　5、采用電泳遷移率檢測（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）實驗檢測構建的重組蛋白rTgPuf2-His中Puf結構域的RNA結合活性。
　　6、培養(yǎng)構建

11、的C2號TgPuf2-HA轉基因蟲株，收集蟲體后進行免疫共沉淀(Immunoprecipitation，IP)實驗，獲得沉淀后進行總RNA的提取后送質譜分析，檢測與Puf2相結合的RNA種類。
　　結果:
　　1、采用RT-PCR實驗，證明在RH株剛地弓形蟲中有Puf2基因。
　　2、比較TgPuf2在速殖子期和緩殖子期mRNA水平，RT-qPCR結果顯示TgPuf2在mRNA水平緩殖子期低于速殖子期。
　　3、

12、通過免疫熒光實驗(IFA)和Western blot鑒定，成功構建了TgPuf2-HA的轉基因弓形蟲蟲株。挑選兩個單克隆蟲株C1、C2作為后續(xù)蛋白表達的分析。用抗HA抗體通過Western blot檢測顯示一條大約206kDa大小的條帶，與預測TgPuf2融合HA×3標簽表達蛋白分子量大小相符，其母本蟲株RHΔKu80未見反應條帶。
　　4、用抗HA抗體通過IFA實驗觀察，發(fā)現(xiàn)TgPuf2主要定位于蟲體胞漿中。
　　5、重組