重組NDVHN基因減毒雞白痢沙門菌的構建及其特性研究.pdf

1、新城疫是由新城疫病毒引發(fā)的一種急性和高度接觸性禽類疾病，對世界養(yǎng)禽業(yè)造成了毀滅性的破壞，世界動物衛(wèi)生組織將其列入必須進行通報的動物疾病之一。近年來，由于傳統(tǒng)疫苗對新城疫預防的種種缺陷，研制一種新型基因工程疫苗來預防和控制新城疫勢在必行。雞白痢沙門菌（S. Pullorum）是目前危害養(yǎng)雞業(yè)的重要細菌之一，藥物控制該菌易造成生物安全問題，傳統(tǒng)疫苗免疫力不高，因此，將減毒沙門菌作為預防細菌疾病的新型活疫苗是當下控制雞白痢的首選途徑。本試驗在

2、減毒S. Pullorum C79-13Δcrp的基礎上，進一步缺失asd基因，利用其質粒平衡致死系統(tǒng)構建重組菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA-HN)，并對其生物學及免疫學特性進行研究。
　　1.減毒S. Pullorum C79-13ΔcrpΔasd株的構建及其生物學特性
　　本研究以S. Pullorum C79-13Δcrp作為受體菌、大腸桿菌χ7213(pREΔasd)作為供體菌，將二者進行接合轉移，并通過“

3、兩步法”篩選asd基因缺失株，PCR鑒定結果及測序結果顯示，成功構建S. Pullorum缺失株C79-13ΔcrpΔasd。生物學特性結果表明，該菌在DAP陰性環(huán)境中存活的能力喪失，同時也失去了利用麥芽糖、葡萄糖、甘露醇和鼠李糖等碳源的能力；其血清型與野生株C79-13一致，生長速度減慢；能夠在體外穩(wěn)定遺傳asd缺失基因；雛雞口服攻毒試驗結果顯示重組菌株LD50較野生株C79-13升高約3.1×104倍。
　　2.重組NDV H

4、N減毒S.Pullorum的構建及其生物學特性
　　本試驗將PCR擴增出的HN基因片段克隆至無抗性原核表達載體pYA3493，得到重組表達質粒pYA-HN，進而將經(jīng)PCR及酶切鑒定正確的重組質粒導入C79-13ΔcrpΔasd中構建重組菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA-HN)。該重組菌株的生化特性與生長特性與C79-13ΔcrpΔasd基本保持一致；NDV HN基因能夠在體外穩(wěn)定遺傳；SDS-PAGE結果顯示HN基因在重組

5、菌中得到了表達，Western blot結果表明表達蛋白具有良好的免疫原性；重組菌毒力較野生株C79-13升高約3.4×104倍；定植試驗結果顯示，重組菌對雞體具有較好的侵襲力。
　　3.重組菌株C79-13ΔcrpΔasd(pYA-HN)的免疫學特性研究
　　重組菌株口服免疫雛雞，對其免疫學特性進行研究。結果表明，對雞只體重的增加與對照組相比差異不顯著（P>0.05），能顯著刺激雞體免疫器官指數(shù)的增加（P<0.05）；血清

6、HI抗體測定結果顯示，HI抗體水平于免疫后21d時達到最大值（log2=5.3）；重組菌免疫后第21d免疫血清中沙門菌 IgG抗體水平顯著高于對照組（P<0.05）；在重組菌株免疫雞腸道沖洗液中檢測到較 PBS組高水平的分泌型IgA(log2=3.56)；免疫組所分離的淋巴細胞經(jīng)體外刺激后其SI在免疫第21d達到最大值，即1.698，與 PBS組相比差異顯著（P<0.05）；免疫保護試驗結果顯示，重組菌免疫組可能100％抵抗沙門菌野生株