重組IBDV-VP2活載體乳酸菌疫苗菌株的構(gòu)建和侵入能力檢測.pdf

1、乳酸菌是人和動物消化道內(nèi)重要的益生菌，是公認(rèn)的安全級（GRAS）微生物，因其佐劑效應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)功能等特點，以乳酸菌做為活疫苗載體表達(dá)外源蛋白研制口服疫苗，具有重要的意義和應(yīng)用前景。
　　實驗?zāi)康模簶?gòu)建重組IBDV-VP2活載體乳酸菌疫苗菌，為乳酸菌活載體疫苗搭建技術(shù)平臺和前期理論支持。
　　實驗方法：本研究利用乳酸球菌NZ3900作為抗原遞呈活載體，以雞傳染性法氏囊病毒強毒株 HJL-0504的抗原蛋白 VP2基因為靶基因，

2、并結(jié)合沙門氏菌侵襲蛋白 RCK基因，構(gòu)建了三株重組乳酸菌，即表達(dá)VP2蛋白的重組L.Lactis-VP2乳酸菌，表達(dá)RCK蛋白的重組 L.Lactis-RCK乳酸菌，融合表達(dá) VP2蛋白和RCK蛋白的重組L.Lactis-VP2-RCK乳酸菌并在體外對RCK蛋白的功能進(jìn)行驗證。
　　實驗結(jié)果：本研究首先利用PCR方法擴(kuò)增得到VP2基因和RCK基因，并分別將其插入到食品級載體pNZ8149質(zhì)粒中，通過電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌NZ39

3、00，得到重組L.Lactis-VP2乳酸菌和重組L.Lactis-RCK乳酸菌。通過nisin誘導(dǎo)劑對重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot驗證VP2蛋白和RCK蛋白分別在重組乳酸菌中正確表達(dá)，且具有較高的穩(wěn)定性，并對其表達(dá)定位進(jìn)一步驗證。為得到最佳的表達(dá)效果，首先對外源基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，然后應(yīng)用正交實驗對誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到OD600=0.5時開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑Nisin終濃度為2 ng/ml，誘導(dǎo)

4、時間為5h的最佳誘導(dǎo)條件，并通過 BCA總蛋白試劑盒和薄層凝膠掃描實驗，對所表達(dá)蛋白定量分析。通過細(xì)胞吸附試驗和激光共聚焦顯微鏡對重組 L.Lactis-RCK乳酸菌進(jìn)行分析，結(jié)果表明通過表達(dá)RCK蛋白能夠使重組乳酸菌獲得吸附細(xì)胞的能力。在此基礎(chǔ)上，我們將VP2蛋白和RCK蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，構(gòu)建重組L.Lactis-VP2-RCK乳酸菌。通過Western blot、細(xì)胞吸附試驗、激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡分析，結(jié)果表明VP2和RCK蛋