多種無機(jī)和有機(jī)砷化物對(duì)Nrf2通路的可能作用.pdf

1、目的：
　　 砷(As)在自然界中分布廣泛，以砷化物的形式存在，砷化物可分為無機(jī)砷和有機(jī)砷兩大類，各種砷化物的化學(xué)性質(zhì)和特點(diǎn)差異很大且十分復(fù)雜。無機(jī)砷化物中最常見的是三氧化二砷(As2O3，又稱砒霜)和亞砷酸鈉(NaAsO2)，化學(xué)形態(tài)均為三價(jià);此外還有砷酸鈉(Na2HAsO4)，化學(xué)形態(tài)則為五價(jià)。有機(jī)砷化物中，五價(jià)的二甲基砷(DMA)是環(huán)境中的主要存在形式。砷化物具有強(qiáng)烈的毒性，并呈現(xiàn)致癌或致畸效應(yīng)。研究普遍認(rèn)為，無機(jī)砷化物的

2、毒性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于有機(jī)砷化物，而無機(jī)砷中則以三價(jià)砷的毒性為最強(qiáng)。盡管已知的砷的毒性均以無機(jī)砷為主，但也有研究提示有機(jī)砷的毒性不容忽視。
　　 另一方面，核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor2，Nrf2)是細(xì)胞調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。生理狀態(tài)下Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性處于相對(duì)抑制狀態(tài);氧化應(yīng)激等因素作用下，Nrf2活化后，啟動(dòng)Nrf2調(diào)控的下游靶分子——抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶等基因表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)

3、氧化應(yīng)激的抵御能力，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡和降低氧化損傷。機(jī)體內(nèi)Nrf2及其調(diào)控的抗氧化酶HO-1和Ⅱ相解毒酶(NQO1、GST)和GSH相關(guān)的抗氧化酶（GCLc、GCLm及GR）都具有直接或間接抗氧化作用，在抗氧化系統(tǒng)和毒物解毒代謝中起著十分重要的作用。
　　 砷在人體內(nèi)的代謝過程主要在肝臟進(jìn)行，肝臟具有復(fù)雜的抗氧化防御系統(tǒng)，其中Nrf2是肝細(xì)胞防御過氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子。不同砷化物對(duì)肝臟系統(tǒng)Nrf2信號(hào)通路的研究無疑

4、對(duì)深入研究砷的生物學(xué)作用具有十分重要的意義。本研究采用Chang肝細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，因其分化特征與正常肝細(xì)胞相似，且是體外研究砷毒性和作用機(jī)制較為合適的細(xì)胞模型，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推至人體更具有現(xiàn)實(shí)意義。
　　 綜上所述，本研究擬以Chang肝細(xì)胞株為研究對(duì)象，探討多種無機(jī)砷化物(NaAsO2、As2O3和Na2HAsO4)和有機(jī)砷化物(DMA)對(duì)Nrf2及Nrf2通路調(diào)控的下游靶分子——抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)

5、的可能影響，并比較不同砷化物對(duì)Nrf2通路活化的作用強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間、以及對(duì)下游靶基因激活的差異等，試圖探討和深入理解多種無機(jī)和有機(jī)砷化物的不同生物學(xué)作用，這將對(duì)揭示砷的生物學(xué)意義具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 研究方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)及染毒
　　 2.Alamar Blue還原法測(cè)定Chang肝細(xì)胞的增殖活力
　　 3.實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)Chang肝細(xì)胞內(nèi)Nrf2及其調(diào)控的下游基因的mRNA表達(dá)水平<

6、br>　　 4.Western blot法分析Chang肝細(xì)胞內(nèi)Nrf2調(diào)控的下游基因的蛋白表達(dá)水平
　　 結(jié)果：
　　 1.通過Alamar Blue測(cè)定還原率表示細(xì)胞增殖活力，來反映四種砷化物的毒性，發(fā)現(xiàn)毒性大小依次為As2O3＞NaAsO2＞ Na2HAsO4＞DMA。
　　 2.特定濃度四種砷化物以不同的時(shí)間點(diǎn)染毒Chang肝細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)，先升高后降低，6h為蛋白表達(dá)最

7、大時(shí)間點(diǎn)。
　　 3.無機(jī)砷化物染毒后，細(xì)胞的Nrf2 mRNA水平表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，隨著染毒濃度的升高，Nrf2 mRNA水平均顯著增加且與對(duì)照組相比;而有機(jī)砷化物DMA染毒時(shí)，染毒組與對(duì)照組相比，Nrf2 mRNA水平幾乎沒變化。
　　 4.四種砷化物以不同的濃度染毒Chang肝細(xì)胞6h后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞Nrf2調(diào)控基因HO-1、NQO1、GSTO-1、GSTO-2、GCLc、GCLm、GR mRNA水平呈現(xiàn)出隨著濃度升高

8、而上升的趨勢(shì)，但各個(gè)基因的表達(dá)并不相同。
　　 5.不同濃度的無機(jī)砷染毒Chang肝細(xì)胞6h后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞Nrf2調(diào)控的蛋白表達(dá)趨勢(shì)相同，隨著染毒濃度的升高，HO-1、NQO1、GCLc和GCLm的蛋白表達(dá)水平逐漸增加;GST和GR的蛋白表達(dá)與染毒濃度無關(guān)，三個(gè)組都表達(dá)且相同;而有機(jī)砷DMA正好相反，隨著染毒濃度的升高，GST和GR的蛋白表達(dá)水平逐漸增加，HO-1、NQO1、GCLc、GCLm的蛋白表達(dá)水水平與染毒濃度無關(guān)，染毒組