全真一氣湯通過Nrf2通路對慢性阻塞性肺疾病的調(diào)控作用研究.pdf

1、【研究背景與目的】
　　全真一氣湯為清代名醫(yī)馮兆張《馮氏錦囊秘錄》中的著名方劑，由熟地黃、麥冬、白術(shù)、人參、熟附子、牛膝、五味子組成。熟地黃滋陰補腎，麥冬補肺潤燥，白術(shù)補脾利水，三者相配，金水相生，共補肺脾腎三臟；人參大補元氣；附子引火歸元；牛膝補腎納氣，五味子收斂五臟之氣，諸藥配伍，補中有瀉，有大補真元、溫腎健脾、補氣利水之功，主治中風大病陰虛發(fā)熱，吐血咳喘，一切虛勞重癥。臨床常用于治療慢性阻塞性肺疾病及頑固性心力衰竭等疾病[1

2、]。多糖是由10個以上的單糖通過核苷鍵鏈接形成的含醛基的天然高分子聚合物，廣泛存在于動物、植物、微生物中，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、等生理作用[2-3]。本課題組研究全真一氣湯多年，成功提取并測定了其多糖的含量[4]。研究證實全真一氣湯可緩解和改善COPD患者臨床癥狀、增強肺功能；全真一氣湯多糖可增強正常小鼠及環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠的免疫功能[5-6]，有改善小鼠全身癥狀，增強免疫力的作用[7]。
　　慢性阻塞性肺疾病(chron

3、ic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續(xù)性氣流受限為特征的可以預防和治療的疾病，氣流受限呈進行性發(fā)展，發(fā)病機制主要涉及炎癥、氧化/抗氧化失衡、蛋白酶/抗蛋白酶失衡三方面。COPD發(fā)病的主要危險因素之一是長期吸煙[8]，香煙煙霧成分復雜，含有多種致癌物質(zhì)[9-10]，可促進氧自由基的活化，誘導中性粒細胞釋放蛋白酶，破壞肺彈力纖維，引起氣道慢性炎癥[11]和氧化應(yīng)激失衡[12]。COPD發(fā)病過

4、程中，肺部與氣道的異常炎癥反應(yīng)與有害顆氣體或顆粒有關(guān)[13]。有害氣體或顆粒進入呼吸道后激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進炎癥細胞釋放多種細胞介質(zhì)如SOD、MDA、IL-6、TNF-α等[14]。香煙煙霧引發(fā)的慢性炎癥反應(yīng)，干擾機體修復功能和防御機制[15]，進一步加強氧化/抗氧化失衡和炎癥反應(yīng)，破壞肺和氣道的正常生理結(jié)構(gòu)，造成氣道狹窄甚至不完全堵塞，導致COPD的發(fā)生。
　　在COPD發(fā)病過程中，香煙煙霧可誘導氧化應(yīng)激失衡及炎癥反應(yīng)，造成肺

5、損傷，肺泡上皮細胞就是其主要靶細胞之一[16]。因此我們采用香煙煙霧提取物刺激人肺泡 II型上皮細胞A549細胞株建立體外模型，通過Nrf2通路從抗炎抗氧化的角度探討全真一氣湯多糖治療COPD的分子機制；采用香煙煙霧暴露聯(lián)合脂多糖（LPS）滴鼻方法建立C57小鼠體內(nèi)COPD模型，觀察小鼠在COPD發(fā)病過程中氧化因子炎癥因子等的表達變化和全真一氣湯對COPD的調(diào)控作用。本實驗為COPD的機制研究及新藥物的開發(fā)提供思路和理論依據(jù)，并為 CO

6、PD的中藥聯(lián)合治療尋找新靶點和確立合適的方案奠定基礎(chǔ)。
　　【研究內(nèi)容與方法】
　　1.全真一氣湯多糖對香煙煙霧提取物誘導的A549細胞的作用機制研究
　?。?）體外培養(yǎng)A549細胞，加入不同濃度的全真一氣湯多糖，相差倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學的變化，MTT法檢測全真一氣湯多糖對細胞存活率的影響，篩選出最佳實驗濃度。
　?。?）收集細胞培養(yǎng)液上清，Elisa方法檢測IL-6、IL-8、TNF-α等炎性因子的含量。

7、
　?。?）裂解細胞收集蛋白，用Western Blotting方法檢測A549細胞中Nrf2、ERK1/2、Akt、P38等蛋白水平表達。
　　2.全真一氣湯及其多糖對COPD小鼠的療效研究
　　（1）采用香煙煙霧暴露聯(lián)合脂多糖（LPS）滴鼻方法制備穩(wěn)定期COPD小鼠模型。
　?。?）造模結(jié)束后收取肺泡灌洗液（BALF）進行炎性細胞總數(shù)計數(shù)，Elisa方法檢測分析IL-6、KC等炎性因子的表達。
　?。?

8、）造模結(jié)束后收集肺組織勻漿，采用TBA法、羥胺法、比色法測定MDA、SOD和GSH-PX等氧化應(yīng)激因子的含量。
　?。?）Western Blotting方法檢測小鼠肺組織勻漿中Nrf2、ERK1/2、Akt、P38等蛋白水平的表達變化。
　　【研究結(jié)果】
　　1.全真一氣湯多糖對香煙煙霧提取物誘導的A549細胞的作用機制研究
　　（1）全真一氣湯多糖對人肺泡上皮A549細胞的存活率的影響：不同濃度全真一氣湯多糖

9、作用于A549細胞不同時間，結(jié)果示10 mg/ml全真一氣湯多糖處理24 h，對A549細胞增殖影響最小。
　?。?）全真一氣湯多糖對人肺泡上皮A549細胞因子IL-6、IL-8的影響：Elisa方法檢測炎性因子，結(jié)果顯示與對照組相比較，模型組細胞因子IL-6、IL-8表達量均上調(diào)（P＜0.05）；而全真一氣湯多糖組與模型組組相比，IL-6、IL-8均下降（P＜0.05）。
　?。?）全真一氣湯多糖對人肺泡上皮A549細胞A

10、kt和P38蛋白的影響：Western Blot法檢測胞漿蛋白結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組Akt和P38蛋白磷酸化量升高（P＜0.05）；加入全真一氣湯多糖組干預后，Akt和P38磷酸化表達量均下降（P＜0.05）。
　?。?）全真一氣湯多糖對人肺泡上皮A549細胞Nrf2和ERK1/2蛋白的影響：Western Blot法檢測蛋白結(jié)果顯示，模型組Nrf2入核量和ERK1/2磷酸化增加（P＜0.05），加入全真一氣湯多糖干預

11、A549細胞后，與模型組相比較，Nrf2和ERK1/2蛋白表達量下降明顯（P＜0.05）。
　　2.全真一氣湯及其多糖對COPD小鼠的療效研究
　　（1）全真一氣湯及其多糖對COPD小鼠BALF中炎性細胞總數(shù)的影響：與對照組相比，模型組小鼠BALF中炎性細胞總數(shù)明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，全真一氣湯及多糖組炎性細胞總數(shù)降低（P＜0.05）。
　　（2）全真一氣湯及其多糖對COPD小鼠BALF中炎癥因子的影響

12、：ELISA法檢測BALF中炎性因子，與對照組相比，模型組IL-6、KC含量明顯增加（P＜0.05），而全真一氣湯及其多糖組IL-6、KC均較模型組減少（P＜0.05）。
　?。?）全真一氣湯及其多糖對 COPD小鼠肺組織氧化因子的影響：與對照組比較，模型組小鼠肺勻漿中SOD和GSH-PX活性明顯降低（P＜0.05），MDA含量增加（P＜0.05）；與模型組相比，全真一氣湯及其多糖組SOD和GSH-PX活性顯著增加（P＜0.05）

13、， MDA含量減少（P＜0.05）。
　?。?）全真一氣湯及其多糖對COPD小鼠肺組織Akt和P38蛋白表達的影響：與對照組相比，模型組小鼠肺組織勻漿中Akt和P38蛋白磷酸化增加（P＜0.05）；與模型組相比，全真一氣湯及其多糖組Akt和P38磷酸化表達量均下降，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　?。?）全真一氣湯及其多糖對COPD小鼠肺組織Nrf2和ERK1/2蛋白表達的影響：與對照組比較，模型組小鼠肺勻漿Nrf2入核

14、量和ERK1/2磷酸化增加（P＜0.05），加入全真一氣湯及其多糖干預后，與模型組比較，Nrf2入核量和ERK1/2磷酸化下降明顯（P＜0.05），P38磷酸化表達下降明顯。
　　【研究結(jié)論】
　　1.全真一氣湯多糖對香煙煙霧提取物誘導的肺泡上皮A549細胞有保護作用，具有一定的抗炎抗氧化作用；
　　2.全真一氣湯及其多糖能緩解治療香煙煙霧暴露聯(lián)合LPS滴鼻誘導的COPD模型小鼠的癥狀；
　　3.全真一氣湯及其多