熱應激對豬和小鼠睪丸組織損傷及tBHQ介導Nrf2信號通路保護作用的研究.pdf

1、公豬生殖力表現(xiàn)為季節(jié)性變化。在炎熱的夏季，公豬精液品質降低，生殖力低下。升高的環(huán)境溫度會誘發(fā)公豬精液品質的改變，比如精子活力降低和精子頂體完整率下降以及精子畸形率升高。因此，揭示熱應激對睪丸生精細胞損傷機制，尋找緩解或預防熱應激的方法具有一定生產意義。熱通常誘導細胞產生活性氧簇(ROS)，包括超氧化物自由基、過氧化氫和羥基自由基。當活性氧簇產生量超過機體細胞抗氧化系統(tǒng)清除能力時，組織細胞就會產生氧化應激。睪丸組織中的多余ROS可被細胞內

2、多種抗氧化酶清除，例如谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、血紅素加氧酶1(OH-1)、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞基(GCLC)和NAD(P)H:醌氧化還原酶1(NQO1)等。紅系衍生的核因子2相關因子2（Nrf2）在各組織細胞抗氧化應激反應中處于核心地位。近年研究發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2-ARE抗氧化信號通路可上調細胞內抗氧化酶類基因的表達，如HO-1、NQO1和GCLC增強細胞抗氧化能力，發(fā)揮抗氧化作用。在眾多Nrf2誘導物中，叔丁基對苯二酚(t

3、BHQ)可通過Nrf2激活許多下游抗氧化基因的表達。因此，通過Nrf2誘導劑tBHQ上調睪丸組織中抗氧化酶，進而提高細胞抗氧化能力，不失為一個有效預防熱應激的方法。本試驗首先通過精液品質檢測研究夏季高溫對公豬精子生成的影響，然后采用免疫組織化學染色法檢測了Nrf2蛋白在小鼠睪丸組織中表達，并利用RIA、RT-PCR等方法檢測了熱應激小鼠睪丸的相對重量，氧化應激參數(shù)，Cleaved caspase 3陽性表達細胞數(shù)量以及Nrf2及其相關基

4、因的表達，就tBHQ可能的緩解機制進行了深入分析研究。主要研究結果如下:
　　1.夏季高溫對大白公豬精子生成的影響
　　為了闡明夏季高溫環(huán)境導致公豬精液質量低下的機理，本試驗選用5頭性成熟大白公豬，并施以3天連續(xù)高溫暴露。熱暴露前2周和熱暴露后6周，每間隔3天，采集精液1次，并檢測精液品質:精液體積、精子總數(shù)、精子活力、精子畸形率、精漿成分，以及精漿和血清中睪酮濃度。試驗結果表明，與熱暴露前相比，大白公豬熱暴露后第2周末，精

5、子總數(shù)顯著降低(P＜0.05)。精子畸形率在大白公豬熱暴露第3到第5周期間，顯著升高(P＜0.05)，而精子活力顯著下降(P＜0.05)。另外，精液體積，血清中睪酮含量，大白公豬精漿中離子濃度以及總蛋白和白蛋白含量在熱暴露前后都沒有顯著變化。大白公豬精子畸形率和精子活力在熱暴露6周后逐漸恢復正常值。試驗結果表明，大白公豬熱暴露可能損害精母細胞和精細胞的發(fā)育，進而擾亂公豬精子生成，降低了公豬精液品質。
　　2.全身熱應激對小鼠睪丸組

6、織損傷及Nrf2保護作用的研究
　　本研究旨在闡明熱應激小鼠睪丸中Nrf2與熱應激誘導的氧化應激的關系。雄性小鼠每天暴露于高環(huán)境溫度(42℃)中2小時。連續(xù)12天熱處理，分別于熱處理后第1、2、4、8和12天，采集睪丸樣品，測定睪丸重量，睪丸組織抗氧化酶活性和丙二醛和谷胱甘肽含量;利用免疫組織化學方法檢測Nrf2蛋白的表達，利用實時定量PCR方法檢測Nrf2及其下游調控基因的表達。熱處理后，小鼠直腸、陰囊表面和體表溫度顯著增加。隨

7、著熱處理天數(shù)的增加，血清中皮質醇和睪酮的濃度出現(xiàn)波動。持續(xù)12天高溫處理導致小鼠體重和睪丸重量顯著下降，丙二醛含量顯著升高，過氧化氫酶活力顯著下降;熱處理第4天，睪丸組織谷胱甘肽含量顯著增加;總超氧化物歧化酶和銅鋅超氧化物歧化酶的活性在第8天和第12天熱處理后顯著增加。此外，小鼠熱處理后第3天，睪丸組織中生精上皮細胞以及間質細胞中Nrf2表達強烈，尤其間質組織中Nrf2蛋白發(fā)生明顯入核;Nrf2及其下游調控基因HO-1和GCLC顯著升高

8、。結果表明熱應激可減少睪丸組織重量，引起睪丸組織氧化應激，胞質胞核中強烈表達的Nrf2以及增加的抗氧化基因表達暗示Nrf2可能是保護生殖細胞和間質細胞免受氧化應激的一個新的靶點。
　　3.陰囊熱應激小鼠對睪丸組織損傷及Nrf2保護作用的研究
　　為了闡明熱應激對小鼠睪丸Nrf2-ARE抗氧化系統(tǒng)的影響。本試驗設計利用8周齡ICR小鼠施以一次陰囊42℃下25min水浴熱處理，并在熱處理后的3h、1、2、7和14天后，采集小鼠睪

9、丸組織樣品進行組織形態(tài)學，免疫組織化學以及實時定量PCR等分析。熱應激導致小鼠睪丸生精上皮嚴重損傷，主要表現(xiàn)為產生多核巨細胞和生精細胞脫落。氧化應激指標丙二醛含量在熱處理后3h和第1天顯著增加;睪丸組織谷胱甘肽含量和谷胱甘肽過氧化物酶超氧化物歧化酶以及銅鋅超氧化物岐化酶在熱處理后都出現(xiàn)顯著性降低;小鼠熱應激后第1天和第2天，睪丸組織中Cleaved caspase 3蛋白陽性細胞比率顯著增加;小鼠陰囊熱應激還誘導了Nrf2蛋白表達，尤其

10、間質細胞中表達明顯;小鼠熱應激后第1天，睪丸組織Nrf2及其相關調控基因GCLC和NQO1相對表達量顯著升高。以上結果表明，小鼠陰囊熱應激誘導睪丸組織氧化應激，損傷睪丸生精上皮，并伴隨Nrf2-ARE抗氧化信號通路的激活。
　　4.tBHQ不同處理方法對陰囊熱應激小鼠睪丸損傷的保護作用
　　為了研究tBHQ對陰囊熱應激誘導的小鼠睪丸組織損傷的影響，本試驗利用8周齡雄性ICR小鼠，分別通過預飼喂1周添加tBHQ(1％w/w)的

11、日糧，腹腔預注射tBHQ（100mg/kgBW），或者睪丸預注射tBHQ（12.5mg/kgBW）的方法，建立小鼠tBHQ給藥模型。小鼠tBHQ預處理后，施以陰囊熱處理(42℃，25min)。陰囊熱應激48h后，采集血清和睪丸組織樣品分析。與對照組相比，日糧飼喂和腹腔注射tBHQ組小鼠睪丸組織具有相對緊湊的間質組織和相對完好的生精上皮結構。睪丸注射tBHQ導致睪丸組織疏松和大量生精小管塌陷。另外，三種方法的tBHQ預處理都導致了睪酮濃度

12、降低和細胞色素P45017α-羥化酶/17，20-裂解酶(CYP17)的表達下降。這一結果表明，tBHQ可能通過抑制類固醇合成導致睪酮分泌減少。通過日糧飼喂或腹腔注射tBHQ能一定程度上緩解陰囊熱應激造成的睪丸組織損傷，并且適量的tBHQ可成為緩解雄性動物睪丸組織熱應激的有效抗氧化劑。
　　5.tBHQ激活Nrf2信號通路對陰囊熱應激小鼠睪丸損傷保護作用的研究
　　本文旨在揭示預飼tBHQ對Nrf2-ARE信號通路的影響以及

13、tBHQ緩解陰囊熱應激小鼠睪丸組織可能的機制。陰囊熱應激前，8周齡ICR小鼠預飼喂1周添加tBHQ(1％w/w)的日糧。飼養(yǎng)結束后，給試驗小鼠施以單次陰囊熱處理(42℃，25min)，然后在熱處理后的3h、1天、2天和7天，采集血清和睪丸樣品。預飼tBHQ可以維持陰囊熱應激小鼠睪丸組織的完整性，表現(xiàn)為相對緊密的間質和相對完整的生精上皮。預飼tBHQ使小鼠睪丸丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量以及谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶(CA

14、T)活力顯著升高。陰囊熱應激處理后，預飼tBHQ組小鼠睪丸組織MDA含量顯著低于未預飼tBHQ組小鼠，并且GSH含量以及CAT酶活力顯著高于未預飼tBHQ組小鼠。另外，與未預飼tBHQ組小鼠相比，預飼tBHQ使小鼠睪丸組織間質Nrf2明顯表達，并且Nrf2及其調控基因HO-1和NQO1中mRNA表達顯著增高。上述結果表明，tBHQ預處理可能通過誘導小鼠睪丸組織產生氧化應激，誘導細胞內酶類和非酶類抗氧化物質上調，并激活Nrf2-ARE抗氧