重組真核表達質粒pVAX1-SPG的構建及表達研究.pdf

1、齲病是一種細菌感染性疾病，其中變異鏈球菌族細菌是其主要病原菌。主要包括變異鏈球菌（S.mutans）和遠緣鏈球（S.sobrinus，又稱茸毛鏈球菌、表兄鏈球菌）。粘附是變異鏈球菌族細菌致齲的基礎，變異鏈球菌表面蛋白（surfaceprotein antigen，SpaP）和葡聚糖結合蛋白（glucan-binding proteins，Gbp）是變異鏈球菌重要的粘附毒力因子，參與介導細菌在牙面的粘附，并具有良好的免疫原性，能夠誘導機體

2、產(chǎn)生保護性免疫應答。
　　 本實驗擬將變異鏈球菌表面蛋白SpaP的P區(qū)和葡聚糖結合蛋白Gbp的編碼基因spap-P和gbd嵌合到真核表達載體pVAX1中，構建真核重組質粒pVAX1-SPG。并將重組質粒轉染哺乳動物細胞觀察目的蛋白的表達，為進一步的動物實驗研究提供物質基礎。
　　 方法：本研究共分為兩個實驗
　　 實驗一重組真核表達質粒pVAX1-SPG的構建以變異鏈球菌基因組DNA為模板，PCR擴增變異鏈球菌表

3、面蛋白P區(qū)編碼基因spap-P和葡聚糖結合蛋白GbpA的GBD編碼基因gbd，分別將目的基因 spap-P和gbd定向克隆到真核載體pVAX1中，構建重組質粒pVAX1-SP、pVAX1-GG。經(jīng)KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切驗證目的基因定向插入真核載體pVAX1后，重新設計引物，將基因spap-P的和gbd嵌合到真核載體pVAX1中，構建重組質粒pVAX1-SPG，酶切鑒定和測序分析。
　　 實驗二重組真核表達質粒pVAX1-SP

4、G在293T細胞中的表達將重組質粒pVAX1-SPG通過Lipofectamine2000轉染至真核細胞293T中，SABC法檢測重組質粒pVAX1-SPG能否在真核細胞中表達目的蛋白。
　　 結果：
　　 （1）經(jīng)PCR擴增出1.2kb的變異鏈球菌表面蛋白P區(qū)編碼基因 spap-P和1.18kb的葡聚糖結合蛋白GbpA的GBD編碼基因gbd：重組質粒pVAX1-SP經(jīng)KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切后電泳可見3.0kb和1.

5、2kb兩條帶，重組質粒pVAX1-GG經(jīng)KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切后電泳可見3.0kb和1.18kb兩條帶，重組質粒pVAX1-SPG經(jīng)KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切后電泳可見3.0kb和2.4kb兩條帶，目的片段大小與設計相符；測序驗證重組質粒pVAX1-SPG中目的基因片段核苷酸序列同源性達99％，插入位置正確，讀碼框未發(fā)生改變。
　　 （2）重組質粒pVAX1-SPG轉染真核細胞293T后，經(jīng)SABC法檢測，實驗組細胞漿內(nèi)有呈