重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SPG的構(gòu)建及表達(dá)研究.pdf

1、齲病是一種細(xì)菌感染性疾病，其中變異鏈球菌族細(xì)菌是其主要病原菌。主要包括變異鏈球菌（S.mutans）和遠(yuǎn)緣鏈球（S.sobrinus，又稱茸毛鏈球菌、表兄鏈球菌）。粘附是變異鏈球菌族細(xì)菌致齲的基礎(chǔ)，變異鏈球菌表面蛋白（surfaceprotein antigen，SpaP）和葡聚糖結(jié)合蛋白（glucan-binding proteins，Gbp）是變異鏈球菌重要的粘附毒力因子，參與介導(dǎo)細(xì)菌在牙面的粘附，并具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體

2、產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬將變異鏈球菌表面蛋白SpaP的P區(qū)和葡聚糖結(jié)合蛋白Gbp的編碼基因spap-P和gbd嵌合到真核表達(dá)載體pVAX1中，構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pVAX1-SPG。并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞觀察目的蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 方法：本研究共分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)
　　 實(shí)驗(yàn)一重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SPG的構(gòu)建以變異鏈球菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增變異鏈球菌表

3、面蛋白P區(qū)編碼基因spap-P和葡聚糖結(jié)合蛋白GbpA的GBD編碼基因gbd，分別將目的基因 spap-P和gbd定向克隆到真核載體pVAX1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-SP、pVAX1-GG。經(jīng)KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切驗(yàn)證目的基因定向插入真核載體pVAX1后，重新設(shè)計(jì)引物，將基因spap-P的和gbd嵌合到真核載體pVAX1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-SPG，酶切鑒定和測序分析。
　　 實(shí)驗(yàn)二重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SP

4、G在293T細(xì)胞中的表達(dá)將重組質(zhì)粒pVAX1-SPG通過Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞293T中，SABC法檢測重組質(zhì)粒pVAX1-SPG能否在真核細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白。
　　 結(jié)果：
　　 （1）經(jīng)PCR擴(kuò)增出1.2kb的變異鏈球菌表面蛋白P區(qū)編碼基因 spap-P和1.18kb的葡聚糖結(jié)合蛋白GbpA的GBD編碼基因gbd：重組質(zhì)粒pVAX1-SP經(jīng)KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切后電泳可見3.0kb和1.

5、2kb兩條帶，重組質(zhì)粒pVAX1-GG經(jīng)KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切后電泳可見3.0kb和1.18kb兩條帶，重組質(zhì)粒pVAX1-SPG經(jīng)KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切后電泳可見3.0kb和2.4kb兩條帶，目的片段大小與設(shè)計(jì)相符；測序驗(yàn)證重組質(zhì)粒pVAX1-SPG中目的基因片段核苷酸序列同源性達(dá)99％，插入位置正確，讀碼框未發(fā)生改變。
　　 （2）重組質(zhì)粒pVAX1-SPG轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞293T后，經(jīng)SABC法檢測，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞漿內(nèi)有呈