視黃酸核受體β介導(dǎo)的ATRA對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成神經(jīng)分化促進(jìn)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分全反式視黃酸對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成神經(jīng)分化的影響觀察及誘導(dǎo)條件優(yōu)化
　　目的：探討不同濃度ATRA預(yù)誘導(dǎo)對(duì)rMSCs神經(jīng)分化效率、細(xì)胞形態(tài)、分化成熟度、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞功能方面的影響作用，以篩選ATRA最佳誘導(dǎo)濃度；并檢測(cè)最佳濃度ATRA預(yù)誘導(dǎo)對(duì)誘導(dǎo)后神經(jīng)元樣細(xì)胞神經(jīng)相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)和神經(jīng)細(xì)胞功能的影響；同時(shí)觀察RA信號(hào)通路中關(guān)鍵受體RARs在ATRA預(yù)誘導(dǎo)促進(jìn)rMSCs神經(jīng)分化過(guò)程中的變化。
　　方法：采用全骨髓培

2、養(yǎng)法分離培養(yǎng)rMSCs，并用流式細(xì)胞術(shù)鑒定rMSCs。采用0、0.01、0.1、1、10、100μM幾個(gè)不同濃度對(duì)rMSCs進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)，后續(xù)采用MNM神經(jīng)誘導(dǎo)液進(jìn)行神經(jīng)分化誘導(dǎo)；計(jì)算rMSCs神經(jīng)分化率，Nikon Elements D軟件測(cè)量分化后神經(jīng)元樣細(xì)胞胞體直徑和軸突長(zhǎng)度；胎盤(pán)藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞死亡率、MTS檢測(cè)神經(jīng)元樣細(xì)胞生長(zhǎng)存活情況、Hoechst熒光染料觀察神經(jīng)元樣細(xì)胞凋亡；Real-time PCR檢測(cè)不同濃度ATRA預(yù)誘導(dǎo)

3、時(shí)神經(jīng)元標(biāo)志物Nestin、NSE、MAP-2的表達(dá)情況。確定最佳ATRA預(yù)誘導(dǎo)濃度后，采用RT-PCR和免疫熒光檢測(cè)不同處理組細(xì)胞神經(jīng)元標(biāo)志物Nestin、NSE、MAP-2和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、CD68、GDNF的表達(dá)情況；并用western blotting檢測(cè)ATRA預(yù)誘導(dǎo)rMSCs神經(jīng)分化不同時(shí)間點(diǎn)Nestin和NSE蛋白表達(dá)的變化趨勢(shì)；然后采用膜片鉗和鈣離子檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)不同處理rMSCs分化后神經(jīng)元樣細(xì)胞功能情況。最后，

4、采用real-time PCR和免疫熒光檢測(cè)不同處理誘導(dǎo)后細(xì)胞RA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路RARs表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　(1)rMSCs的分離培養(yǎng)、擴(kuò)增和流式細(xì)胞鑒定：rMSCs呈梭形，漩渦狀生長(zhǎng)；流式細(xì)胞術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)99％以上的rMSCs表達(dá)CD29、CD44、CD106和CD90，幾乎不表達(dá)CD45和CD34。
　　(2)不同濃度ATRA預(yù)誘導(dǎo)對(duì)rMSCs神經(jīng)分化的作用：經(jīng)MNM誘導(dǎo)后，rMSCs分化為雙極或多極神經(jīng)元細(xì)胞

5、形態(tài)；ATRA濃度在0.01-10μM范圍內(nèi)，ATRA濃度越高，神經(jīng)樣細(xì)胞分化效率越高，神經(jīng)元胞體直徑越大，軸突更長(zhǎng)(p<0.05)；1μM濃度ATRA時(shí)，分化后細(xì)胞死亡率和凋亡率最低(P<0.01/p<0.05)；0.01-μM ATRA預(yù)誘導(dǎo)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖沒(méi)有作用，而10μM以上的ATRA預(yù)誘導(dǎo)明顯抑制細(xì)胞增殖；Real-time PCR結(jié)果顯示1μM ATRA預(yù)誘導(dǎo)神經(jīng)分化細(xì)胞神經(jīng)相關(guān)標(biāo)志物Nestin、NSE、MAP-2的表達(dá)

6、最高；1μM濃度ATRA預(yù)誘導(dǎo)為最佳濃度。
　　(3)ATRA預(yù)誘導(dǎo)提高rMSCs在MNM神經(jīng)誘導(dǎo)環(huán)境下向神經(jīng)元分化：RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATRA單獨(dú)預(yù)誘導(dǎo)不引起成熟神經(jīng)元表面標(biāo)志的表達(dá)，僅神經(jīng)干細(xì)胞Nestin的表達(dá)稍有增加；預(yù)誘導(dǎo)的rMSCs神經(jīng)分化后Nestin、NSE及MAP-2神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)更高，而GFAP、CD68膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)較未預(yù)誘導(dǎo)為低；免疫熒光也顯示，預(yù)誘導(dǎo)的rMSCs神經(jīng)分化后Nestin、NSE

7、及MAP-2神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)更高，而膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物GDNF表達(dá)更低。ATRA預(yù)誘導(dǎo)+MNM神經(jīng)誘導(dǎo)0-36小時(shí)，NSE的表達(dá)逐漸增高，而Nestin表達(dá)先增高，隨后下降，于MNM誘導(dǎo)后18小時(shí)達(dá)頂峰。
　　(4)ATRA預(yù)誘導(dǎo)rMSCs神經(jīng)分化所得神經(jīng)元樣細(xì)胞在功能上具有更大優(yōu)勢(shì)：靜息膜電位顯示，經(jīng)ATRA預(yù)誘導(dǎo)后所得神經(jīng)元樣細(xì)胞較單獨(dú)經(jīng)MNM誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣細(xì)胞有更大負(fù)值膜電位(p<0.05)；鈣影像顯示，經(jīng)ATRA預(yù)誘導(dǎo)

8、的神經(jīng)元樣細(xì)胞則較單獨(dú)MNM誘導(dǎo)分化細(xì)胞鈣振蕩效應(yīng)更強(qiáng)(p<0.05)。
　　(5)ATRA，MNM誘導(dǎo)rMSCs神經(jīng)分化過(guò)程中RARs的表達(dá)變化：RARα、RARγ在rMSCs中有較高的表達(dá)，但RARβ幾乎不表達(dá)；rMSCs經(jīng)MNM誘導(dǎo)神經(jīng)分化后RARα、RARβ、RARγ不同程度被激活，其中以RARp最為明顯；而僅經(jīng)ATRA預(yù)誘導(dǎo)后rMSCs只有RARβ表達(dá)上調(diào)；ATRA預(yù)誘導(dǎo)rMSCs神經(jīng)分化后RARβ上調(diào)比未經(jīng)ATRA預(yù)誘

9、導(dǎo)rMSCs神經(jīng)分化后更高；另外，rMSCs神經(jīng)分化后RARβ還出現(xiàn)定位表達(dá)變化，向胞核周邊聚集。
　　結(jié)論：
　　(1)通過(guò)全骨髓培養(yǎng)我們成功獲取了rMSCs細(xì)胞，并經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定。
　　(2)rMSCs可以有效地被誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞，而且不僅是形態(tài)上和神經(jīng)標(biāo)志物上，還具有一定的神經(jīng)細(xì)胞功能基礎(chǔ)。
　　(3)ATRA預(yù)誘導(dǎo)能夠促進(jìn)rMSCs神經(jīng)分化，能夠提高分化后神經(jīng)元樣細(xì)胞的存活率并抑制其凋亡發(fā)生，最佳的預(yù)

10、誘導(dǎo)濃度為1μmol/L。
　　(4)ATRA預(yù)誘導(dǎo)促進(jìn)rMSCs向神經(jīng)元方向分化，抑制向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化；所得神經(jīng)元樣細(xì)胞在功能上具有更大優(yōu)勢(shì)。
　　(5)rMSCs神經(jīng)分化過(guò)程中RA信號(hào)被激活，RARβ尤為明顯；RARβ還出現(xiàn)定位表達(dá)變化，ATRA預(yù)誘導(dǎo)促進(jìn)rMSCs神經(jīng)分化可能與預(yù)先激活RARβ信號(hào)有關(guān)。
　　第二部分?jǐn)y帶大鼠視黃酸核受體RARα、RARβ、RARγ基因的重組腺病毒及視黃酸核受體RARβ的si

11、RNA重組腺病毒構(gòu)建及功能鑒定
　　第一章攜帶RARα、RARβ、RARγ基因的重組腺病毒構(gòu)建及功能鑒定
　　目的：構(gòu)建攜帶大鼠視黃酸核受體α、β、γ(retinoic acid receptor α、β、γ，RARα、β、γ)的重組腺病毒，為研究RARα、β、γ在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)成神經(jīng)分化中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：體外擴(kuò)增大鼠RARα、RARβ、RARγ基

12、因，將其定向克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrace-TOX構(gòu)建重組質(zhì)粒pAdTrace-RARα、pAdTrace-RARβ、pAdTrace-RARγ，并在BJ5183菌中與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1重組獲得腺病毒載體pAd-RARα、pAd-RARβ、pAd-RARγ，Pac I酶切后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞包裝腺病毒。腺病毒Ad-RARα、Ad-RARβ、Ad-RARγ感染大鼠MSCs，real time PCR和western blo

13、tting檢測(cè)RARα、RARβ、RARγ的表達(dá)。
　　結(jié)果：PCR，酶切及測(cè)序均證實(shí)RARα、RARβ、RARγ正確克隆至腺病毒質(zhì)粒載體中，Ad-RARα、Ad-RARβ、Ad-RARγ對(duì)rMSCs感染率達(dá)60-70％，并明顯增強(qiáng)RARα、RARβ、RARγ基因和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建攜帶RARα、RARβ、RARγ的重組腺病毒，并具有上調(diào)rMSCs中RARα、RARβ、RARγ目的基因和蛋白表達(dá)的功能。

14、　　第二章視黃酸核受體RARβ的siRNA重組腺病毒構(gòu)建及功能鑒定
　　目的：構(gòu)建視黃酸核受體RARβ的siRNA重組腺病毒，為反向研究RARβ受體在ATRA預(yù)誘導(dǎo)促進(jìn)rMSCs成神經(jīng)分化中的確切作用。
　　方法：設(shè)計(jì)4對(duì)大鼠RARβ的siRNA序列，將其分別克隆到pSES-HUS穿梭質(zhì)粒；進(jìn)而將重組穿梭質(zhì)粒pSES-HUS-siRARβ與pAdEasy-1在BJ5183感受態(tài)大腸埃希菌內(nèi)同源重組以得到pAd-siRARβ，

15、Pac I酶切線(xiàn)性化后轉(zhuǎn)染HEK293進(jìn)行包裝擴(kuò)增以得到重組腺病毒Ad-siRARβ；Ad-siRARβ感染rMSCs細(xì)胞48 h，提取各組mRNA和總蛋白，real time PCR和western blotting檢測(cè)Ad-siRARβ-1、-2、-3、-4對(duì)RARβ的抑制效率。
　　結(jié)果：PCR，酶切及測(cè)序均證實(shí)RARβ的siRNA序列正確克隆至腺病毒質(zhì)粒載體，經(jīng)過(guò)包裝擴(kuò)增得到大量高滴度重組腺病毒Ad-siRARβ，其中Ad

16、-siRARβ-1、-2、-3可明顯抑制RARβ表達(dá)，Ad-siRARβ-4沒(méi)有明顯效果，Ad-siRARβ-pool效果最佳。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建視黃酸核受體RARβ的siRNA重組腺病毒，而且對(duì)RARβ基因和蛋白的表達(dá)能夠起特異性下調(diào)作用。
　　第三部分視黃酸核受體在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成神經(jīng)分化的作用探討
　　目的：采用Ad-RARα、Ad-RARβ、Ad-RARγ分別過(guò)表達(dá)具體某一種RAR亞型來(lái)研究每種RAR核受體

17、信號(hào)對(duì)rMSCs神經(jīng)分化的影響；采用Ad-siRARβ及RARβ特異性拮抗劑下調(diào)或阻斷RARβ信號(hào)來(lái)反向研究RARβ信號(hào)在ATRA預(yù)誘導(dǎo)對(duì)rMSCs神經(jīng)分化中的作用。
　　方法：設(shè)定Ad-RFP、Ad-RFP+MNM、Ad-RFP+RA+MNM、Ad-RARα+MNM、Ad-RARβ+MNM、Ad-RARγ+MNM共計(jì)六組，加入一定量Ad-RARα、Ad-RARβ、Ad-RARγ于完全培養(yǎng)基中，病毒對(duì)照組加入Ad-RFP，Ad-R

18、FP+RA組同時(shí)加入Ad-RFP和RA進(jìn)行預(yù)處理，24小時(shí)后棄培養(yǎng)基并用D-Hank’s漂洗兩次，加入MNM成神經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)24小時(shí)后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；設(shè)定Ad-RFP+MNM、Ad-RFP+RA+MNM、Ad-siRARIB+RA+MNM、LE135+RA+MNM共計(jì)四組，加入一定量Ad-RFP、Ad-siRARβ處理24小時(shí)后，再加入RA，LE135+RA+MNM組則同時(shí)加入LE135+RA處理24小時(shí)后，棄培養(yǎng)基并用D-Hank’s

19、漂洗兩次，加入MNM成神經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)24小時(shí)后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。后續(xù)采用real time PCR、western blotting和免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)分化后細(xì)胞神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況；然后采用膜片鉗和鈣離子檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)不同處理rMSCs分化后神經(jīng)元樣細(xì)胞功能情況。
　　結(jié)果：
　　(1)RARα和RARγ過(guò)表達(dá)時(shí)Nestin、NSE、MAP-2、Tau和β-Ⅲ-tubulin等神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)與Ad-RFP空載感染rM

20、SCs組大概一致，而RARβ過(guò)表達(dá)時(shí)以上神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)則高于Ad-RFP空載對(duì)照組，且與ATRA預(yù)誘導(dǎo)組相當(dāng)；另外，RARα和RARγ過(guò)表達(dá)時(shí)誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞靜息膜電位和鈣離子震蕩效應(yīng)與Ad-RFP空載感染rMSCs組大概一致，而RARβ過(guò)表達(dá)時(shí)誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞靜息膜電位和鈣離子震蕩效應(yīng)明顯強(qiáng)于Ad-RFP空載感染組且基本與ATRA預(yù)誘導(dǎo)組相似。
　　(2)Ad-siRARB沉默或LE135特異性阻斷ATRA預(yù)誘

21、導(dǎo)對(duì)RARβ激活作用后，rMSCs神經(jīng)分化后Nestin、NSE、MAP-2、Tau和β-Ⅲ-tubulin等神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)較阻斷前ATRA預(yù)誘導(dǎo)組明顯降低；而且rMSCs成神經(jīng)分化后細(xì)胞靜息膜電位和鈣離子震蕩效應(yīng)也較ATRA預(yù)誘導(dǎo)組明顯降低。
　　結(jié)論：
　　(1)預(yù)先激活RARα和RARγ信號(hào)對(duì)于rMSCs神經(jīng)分化影響不大，沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用。
　　(2)預(yù)先激活RARβ信號(hào)促進(jìn)rMSCs神經(jīng)分化和功能成熟，