ATM-Chk2-p53通路在B[a]P致神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、目的:
　　通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 ATM/Chk2-p53通路在苯并[a]芘致大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡中作用，初步探討苯并[a]芘致神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制。
　　方法:
　　挑選50只雄性 SD大鼠按體重隨機(jī)分5組即空白對(duì)照組，0mg/kg，1.0mg/kg,2.5mg/kg和6.25mg/kgB[a]p組。采用腹腔注射隔日染毒建模，喂養(yǎng)3批老鼠150只，染毒1,2,3個(gè)月。染毒結(jié)束后處死大鼠，摘取腦組織石蠟包埋切片，TUNEL

2、法測皮質(zhì)組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡；Immunohistochemistry法檢測皮質(zhì)組織BPDE-DNA adduct；取皮質(zhì)組織提取蛋白Western-blot法檢測ATM, ATMser794,Chk2, Chk2thr68, P53, P53ser20, Cleaved Caspase3,Puma蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、神經(jīng)細(xì)胞凋亡TUNEL檢測:隨著苯并[a]芘染毒時(shí)間與劑量增加，皮質(zhì)組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率出現(xiàn)增高趨勢。

3、苯并[a]芘2.5mg/kg組與空白對(duì)照組相比，染毒1,2和3個(gè)月時(shí)凋亡率分別增加0.59、0.93和1.58倍(P<0.05)。6.25mg/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比，染毒1,2和3個(gè)月時(shí)凋亡率分別增加0.85、1.69和3.75倍，染毒三個(gè)月后凋亡率高達(dá)23.49％(P<0.05)。析因分析顯示染毒時(shí)間與劑量存在交互作用(F=13.923， P<0.001)。
　　2、皮質(zhì)組織BPDE-DNA adduct含量隨著B[

4、a]P染毒劑量和時(shí)間增加呈現(xiàn)增高趨勢， B[a]P染毒三個(gè)月時(shí)6.25mg/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比分別增加161.5%(P<0.05)。析因分析顯示染毒時(shí)間與劑量存在交互作用(F=2.731，P=0.022)。
　　3、Western blot對(duì)大鼠皮質(zhì)組織ATM/Chk2-p53通路檢測顯示，苯并[a]芘染毒三個(gè)月時(shí)，ATM蛋白表達(dá)量在1.0、2.5、6.25mg/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比分別增加20.7%,1

5、7.2%，28.7%(P<0.05)。苯并[a]芘染毒1,2和3個(gè)月時(shí)1.0mg/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比，ATMser794蛋白表達(dá)量分別增加11.5%、34.7%和35.0%(P<0.05)。苯并[a]芘染毒1,2和3個(gè)月時(shí)2.5mg/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比，ATMser794蛋白表達(dá)量分別增加31.9%、17.9%和45.5%(P<0.05)。苯并[a]芘染毒1,2和3個(gè)月時(shí)6.25mg/kgB[a]P組與空白對(duì)

6、照組相比，ATMser794蛋白表達(dá)量分別增加46.4%、34.6%和62.3%(P<0.05)。苯并[a]芘染毒2和3個(gè)月時(shí)1.0mg/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比， Chk2蛋白表達(dá)量分別增加63.5%和61.6%(P<0.05)。苯并[a]芘染毒2和3個(gè)月時(shí)2.5mg/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比，Chk2蛋白表達(dá)量分別增加60.0%和87.7%(P<0.05)。苯并[a]芘染毒1,2和3個(gè)月時(shí)6.25mg/kgB[a]P

7、組與空白對(duì)照組相比，Chk2蛋白表達(dá)量分別增加77.3%、85.8%和165.8%(P<0.05)。苯并[a]芘染毒二、三個(gè)月時(shí)， Chk2thr68蛋白表達(dá)量在6.25mg/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比分別增加92.2%,112.3%(P<0.05)。苯并[a]芘染毒2和3個(gè)月時(shí)1.0mg/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比， p53蛋白表達(dá)量分別增加35.9%和117.8%(P<0.05)。苯并[a]芘染毒1,2和3個(gè)月時(shí)2.5m

8、g/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比，p53蛋白表達(dá)量分別增加83.3%、92.1%和158.9%(P<0.05)。苯并[a]芘染毒1,2和3個(gè)月時(shí)6.25mg/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比，p53蛋白表達(dá)量分別增加108.3%、150.0%和255.3%(P<0.05)。苯并[a]芘染毒1,2和3個(gè)月時(shí)6.25mg/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比，p53ser20蛋白表達(dá)量分別增加31.7%、92.4%和173.4%(P<0.0

9、5)。
　　4、Western blot對(duì)大鼠皮質(zhì)組織Cleaved Caspase3、Puma蛋白表達(dá)，苯并[a]芘染毒1,2和3個(gè)月時(shí)2.5mg/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比，Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)量分別增加49.4%、61.3%和77.7%(P<0.05)。苯并[a]芘染毒1,2和3個(gè)月時(shí)6.25mg/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比，Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)量分別增加55.9%、94.

10、3%和111.1%(P<0.05)。苯并[a]芘染毒1,2和3個(gè)月時(shí)1.0mg/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比，puma蛋白表達(dá)量分別增加43.5%、30.3%和69.5%(P<0.05)。苯并[a]芘染毒1,2和3個(gè)月時(shí)2.5mg/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比，puma蛋白表達(dá)量分別增加77.4%、87.7%和144.1%(P<0.05)。苯并[a]芘染毒1,2和3個(gè)月時(shí)6.25mg/kgB[a]P組與空白對(duì)照組相比，puma蛋

11、白表達(dá)量分別增加93.5%、137.8%和208.5%(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、苯并[a]芘染毒導(dǎo)致大鼠皮質(zhì)組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡和 DNA損傷，且隨著染毒劑量的增加和暴露時(shí)間的延長，損傷趨于嚴(yán)重；在此過程中發(fā)現(xiàn)ATM/Chk2-p53通路相關(guān)蛋白表達(dá)增大，同時(shí)p53下游的Puma、Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)隨著染毒時(shí)間與劑量增加而增大，Cleaved Caspase3蛋白是神經(jīng)細(xì)胞線粒體凋亡中的執(zhí)行蛋