牡蠣提取物在高溫致神經(jīng)細胞凋亡中的保護作用.pdf

1、目的: 優(yōu)生優(yōu)育、提高人口素質(zhì)是關系到國富民強的千年大計。近年來，我國的優(yōu)生優(yōu)育工作取得了顯著成就，但仍有許多問題需要解決，例如：隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展和環(huán)境污染的日趨嚴重，人類先天畸形的發(fā)生率居高不下，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。在這些先天畸形中，神經(jīng)管畸形(Netlral Tube Defects，NTD)最為常見、危害也最大，是影響我國優(yōu)生率的主要原因。高溫是常見的物理致畸因子，可導致多種先天畸形，也是引起神經(jīng)管畸形的重要環(huán)

2、境因素，且孕婦很難避免受其影響。流行病學調(diào)查顯示：神經(jīng)管畸形中有10﹪為高溫所致。目前尚無有效拮抗神經(jīng)管畸形的藥物，故尋找有效的預防及治療高溫致畸的方法，對減少先天畸形的發(fā)生具有重要意義。 牡蠣為海洋貝類動物，富含人體所需的多種營養(yǎng)成分，在歐美素有“Sea，milk”之稱。我國對牡蠣殼和肉的藥用認識最早，一直是臨床常用藥。據(jù)有關的中醫(yī)藥書籍記載，牡蠣具有安胎作用。沿海地區(qū)漁民中也流傳著“懷孕后食用牡蠣不生怪胎”的說法?，F(xiàn)代醫(yī)學研

3、究表明，牡蠣具有多種生物活性，其提取物中富含?；撬峒颁\。?；撬崾且环N條件性必需氨基酸，在組織細胞內(nèi)含量豐富，具有抗氧化及清除體內(nèi)自由基作用，可拮抗缺血心肌細胞的凋亡，對受損傷的細胞具有保護作用。據(jù)報道，?；撬岷弯\還可促進早胚發(fā)育，具有抗致畸作用。動物實驗顯示，高溫可促進胚胎神經(jīng)上皮和周圍間充質(zhì)的細胞凋亡，使存活細胞數(shù)減少，導致神經(jīng)管延遲閉合或不閉合，從而造成無腦、露腦、腦脊膜膨出等神經(jīng)管畸形。?；撬崮苻卓剐募〖毎蛲?，促進早胚發(fā)育，若能

4、拮抗高溫致神經(jīng)管畸形過程中的細胞凋亡，即可拮抗高溫所致神經(jīng)管畸形的發(fā)生。因此，我們提出牡蠣提取物可拮抗高溫致神經(jīng)管畸形的假說。本實驗室在高溫致NTD方面做了大量的研究，建立了高溫致金黃地鼠NTD的動物模型，并在此基礎上對高溫致NTD的形態(tài)發(fā)生機理進行了一系列研究。本實驗擬利用動物在體實驗，觀察不同劑量的牡蠣提取物對高溫所致金黃地鼠神經(jīng)管畸形中凋亡細胞的保護作用；利用體外細胞培養(yǎng)，觀察牡蠣提取物對高溫所致小鼠神經(jīng)干細胞凋亡的保護作用，從而

5、探討牡蠣提取物對高溫致神經(jīng)管畸形的拮抗作用，闡述其可能的作用機制，旨在預防高溫致神經(jīng)管畸形的發(fā)生及指導人們利用天然食物減少出生缺陷。 研究方法： 1．動物在體實驗：取成年未經(jīng)產(chǎn)雌性金黃地鼠(購于北京實驗動物研究中心)36只，于晚7～9時與雄鼠1：1合籠，視其交配，交配者次日定為孕1天。將孕鼠隨機分為對照組和實驗組：對照組孕鼠于孕8天下午3時被置于42°C水浴20min；實驗組又分3組，即牡蠣保護Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，于高溫處理前

6、分別灌服不同劑量的牡蠣提取液。所有孕鼠均按與對照組相同的方法進行高溫處理。將對照組和各牡蠣保護組分別于高溫水浴后8h、16h麻醉處死，取出妊娠子宮，部分標本固定于4﹪多聚甲醛，部分標本固定于改良的bouins固定液，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(厚5μm)，裱片于涂有APES的載玻片上，置45　℃溫箱內(nèi)烤干備染。采用核固紅一結晶紫染色方法，對各組鼠胚神經(jīng)管頭端及周圍間充質(zhì)的凋亡細胞進行定量分析；采用SABC免疫組織化學法及圖像分析技術檢測凋亡

7、相關蛋白Caspase-3在牡蠣保護各組和對照組鼠胚神經(jīng)管頭部相應部位的表達狀況。 2．體外細胞培養(yǎng)：取雌性昆明小鼠與雄性昆明小鼠按2：1合籠交配，次日晨查見陰栓者定為孕第1天。將妊娠13d小鼠處死，取胚鼠大腦皮層，剝?nèi)ツX膜，分離細胞，培養(yǎng)。用巢蛋白抗體(nestin)鑒定神經(jīng)干細胞(netJral stem cells，NSCs)。取培養(yǎng)3代的NSCs接種于96孔板中進行培養(yǎng)，并隨機分為4組，即對照組Ⅰ和牡蠣保護組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，

8、同時設立培養(yǎng)液對照組(對照組Ⅱ)、培養(yǎng)液+牡蠣提取液對照組(對照組Ⅲ)。向各牡蠣保護組中加入不同濃度的牡蠣提取液10μl，進行培養(yǎng)。各組分別于培養(yǎng)36h后經(jīng)高溫處理。采用MTT法檢測對照組和牡蠣保護組中神經(jīng)干細胞的增殖活性，以判斷牡蠣提取液對神經(jīng)干細胞凋亡的保護作用；采用Westerrl blotting檢測各組細胞中凋亡相關蛋白p53的表達狀況。 結果： 1．核固紅-結晶紫染色結果：高溫處理后8h，對照組神經(jīng)上皮排列不

9、整齊，凋亡細胞數(shù)目較多，周圍間充質(zhì)凋亡細胞也較多。高溫后16h，神經(jīng)上皮細胞凋亡數(shù)明顯增多。與對照組相比，牡蠣保護Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組鼠胚神經(jīng)上皮及其周圍間充質(zhì)在高溫處理后8h、16h細胞凋亡數(shù)目明顯減少，細胞凋亡指數(shù)明顯下降。 2．Caspase-3的免疫組化染色結果：Caspa，se-3陽性細胞散在于神經(jīng)上皮及間充質(zhì)內(nèi)，有的細胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒，有的細胞質(zhì)與細胞核內(nèi)均可見棕黃色顆粒。對照組高溫后8h、16h鼠胚神經(jīng)上皮中可見少量Ca

10、spase-3陽性表達細胞，各牡蠣保護組中神經(jīng)上皮細胞中Caspase-3呈弱陽性或陰性表達。圖像分析結果顯示，各牡蠣保護組Caspase-3陽性神經(jīng)上皮細胞OD值明顯低于相應對照組。 3．神經(jīng)干細胞的原代培養(yǎng)及鑒定：培養(yǎng)24h后，出現(xiàn)大小不等的神經(jīng)球，每個球包含4-20個細胞。隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，球體逐漸增大，光滑，無明顯突起，細胞大小較均勻，折光性強。傳代后，細胞增殖迅速，球體也增大。免疫熒光染色結果顯示，神經(jīng)球中大多數(shù)細胞n

11、estin呈陽性反應。 4．MTT檢測結果：與對照組Ⅰ相比，牡蠣保護組Ⅰ的神經(jīng)球無明顯差別，牡蠣保護組Ⅱ、Ⅲ的神經(jīng)球體積較大，數(shù)目較多，球體周邊呈花邊狀，球內(nèi)細胞界限清楚，折光性良好。牡蠣保護組Ⅱ、Ⅲ與對照組Ⅰ相比，MTT檢測值明顯增高，減去提取液顏色的影響后，經(jīng)統(tǒng)計學分析，差異顯著(P<0.05)。 5．Western blotting檢測結果：與對照組Ⅰ相比，牡蠣保護組Ⅱ、牡蠣保護組Ⅲp53表達明顯下降。 結

12、論： 1．在體內(nèi)，牡蠣提取物可減少高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形形成過程中的凋亡細胞數(shù)目，并降低凋亡相關蛋白Caspase-3的表達，故該提取物對高溫致NTD發(fā)生過程中的細胞凋亡起到一定的保護作用。 2．在體外，牡蠣提取物可增強高溫處理后的神經(jīng)干細胞的增殖活性，并降低神經(jīng)干細胞中凋亡相關蛋白p53的表達，故對高溫引起的小鼠神經(jīng)干細胞凋亡具有一定的保護作用。 意義： 本實驗研究結果表明，牡蠣提取物對高溫所致金黃地