牡蠣提取物在高溫致神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用.pdf

1、目的: 優(yōu)生優(yōu)育、提高人口素質(zhì)是關(guān)系到國富民強(qiáng)的千年大計(jì)。近年來，我國的優(yōu)生優(yōu)育工作取得了顯著成就，但仍有許多問題需要解決，例如：隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展和環(huán)境污染的日趨嚴(yán)重，人類先天畸形的發(fā)生率居高不下，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。在這些先天畸形中，神經(jīng)管畸形(Netlral Tube Defects，NTD)最為常見、危害也最大，是影響我國優(yōu)生率的主要原因。高溫是常見的物理致畸因子，可導(dǎo)致多種先天畸形，也是引起神經(jīng)管畸形的重要環(huán)

2、境因素，且孕婦很難避免受其影響。流行病學(xué)調(diào)查顯示：神經(jīng)管畸形中有10﹪為高溫所致。目前尚無有效拮抗神經(jīng)管畸形的藥物，故尋找有效的預(yù)防及治療高溫致畸的方法，對減少先天畸形的發(fā)生具有重要意義。 牡蠣為海洋貝類動(dòng)物，富含人體所需的多種營養(yǎng)成分，在歐美素有“Sea，milk”之稱。我國對牡蠣殼和肉的藥用認(rèn)識(shí)最早，一直是臨床常用藥。據(jù)有關(guān)的中醫(yī)藥書籍記載，牡蠣具有安胎作用。沿海地區(qū)漁民中也流傳著“懷孕后食用牡蠣不生怪胎”的說法。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研

3、究表明，牡蠣具有多種生物活性，其提取物中富含牛磺酸及鋅。牛磺酸是一種條件性必需氨基酸，在組織細(xì)胞內(nèi)含量豐富，具有抗氧化及清除體內(nèi)自由基作用，可拮抗缺血心肌細(xì)胞的凋亡，對受損傷的細(xì)胞具有保護(hù)作用。據(jù)報(bào)道，牛磺酸和鋅還可促進(jìn)早胚發(fā)育，具有抗致畸作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，高溫可促進(jìn)胚胎神經(jīng)上皮和周圍間充質(zhì)的細(xì)胞凋亡，使存活細(xì)胞數(shù)減少，導(dǎo)致神經(jīng)管延遲閉合或不閉合，從而造成無腦、露腦、腦脊膜膨出等神經(jīng)管畸形。?；撬崮苻卓剐募〖?xì)胞凋亡，促進(jìn)早胚發(fā)育，若能

4、拮抗高溫致神經(jīng)管畸形過程中的細(xì)胞凋亡，即可拮抗高溫所致神經(jīng)管畸形的發(fā)生。因此，我們提出牡蠣提取物可拮抗高溫致神經(jīng)管畸形的假說。本實(shí)驗(yàn)室在高溫致NTD方面做了大量的研究，建立了高溫致金黃地鼠NTD的動(dòng)物模型，并在此基礎(chǔ)上對高溫致NTD的形態(tài)發(fā)生機(jī)理進(jìn)行了一系列研究。本實(shí)驗(yàn)擬利用動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)，觀察不同劑量的牡蠣提取物對高溫所致金黃地鼠神經(jīng)管畸形中凋亡細(xì)胞的保護(hù)作用；利用體外細(xì)胞培養(yǎng)，觀察牡蠣提取物對高溫所致小鼠神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，從而

5、探討牡蠣提取物對高溫致神經(jīng)管畸形的拮抗作用，闡述其可能的作用機(jī)制，旨在預(yù)防高溫致神經(jīng)管畸形的發(fā)生及指導(dǎo)人們利用天然食物減少出生缺陷。 研究方法： 1．動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)：取成年未經(jīng)產(chǎn)雌性金黃地鼠(購于北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心)36只，于晚7～9時(shí)與雄鼠1：1合籠，視其交配，交配者次日定為孕1天。將孕鼠隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組：對照組孕鼠于孕8天下午3時(shí)被置于42°C水浴20min；實(shí)驗(yàn)組又分3組，即牡蠣保護(hù)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，于高溫處理前

6、分別灌服不同劑量的牡蠣提取液。所有孕鼠均按與對照組相同的方法進(jìn)行高溫處理。將對照組和各牡蠣保護(hù)組分別于高溫水浴后8h、16h麻醉處死，取出妊娠子宮，部分標(biāo)本固定于4﹪多聚甲醛，部分標(biāo)本固定于改良的bouins固定液，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(厚5μm)，裱片于涂有APES的載玻片上，置45　℃溫箱內(nèi)烤干備染。采用核固紅一結(jié)晶紫染色方法，對各組鼠胚神經(jīng)管頭端及周圍間充質(zhì)的凋亡細(xì)胞進(jìn)行定量分析；采用SABC免疫組織化學(xué)法及圖像分析技術(shù)檢測凋亡

7、相關(guān)蛋白Caspase-3在牡蠣保護(hù)各組和對照組鼠胚神經(jīng)管頭部相應(yīng)部位的表達(dá)狀況。 2．體外細(xì)胞培養(yǎng)：取雌性昆明小鼠與雄性昆明小鼠按2：1合籠交配，次日晨查見陰栓者定為孕第1天。將妊娠13d小鼠處死，取胚鼠大腦皮層，剝?nèi)ツX膜，分離細(xì)胞，培養(yǎng)。用巢蛋白抗體(nestin)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞(netJral stem cells，NSCs)。取培養(yǎng)3代的NSCs接種于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，并隨機(jī)分為4組，即對照組Ⅰ和牡蠣保護(hù)組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，

8、同時(shí)設(shè)立培養(yǎng)液對照組(對照組Ⅱ)、培養(yǎng)液+牡蠣提取液對照組(對照組Ⅲ)。向各牡蠣保護(hù)組中加入不同濃度的牡蠣提取液10μl，進(jìn)行培養(yǎng)。各組分別于培養(yǎng)36h后經(jīng)高溫處理。采用MTT法檢測對照組和牡蠣保護(hù)組中神經(jīng)干細(xì)胞的增殖活性，以判斷牡蠣提取液對神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用；采用Westerrl blotting檢測各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白p53的表達(dá)狀況。 結(jié)果： 1．核固紅-結(jié)晶紫染色結(jié)果：高溫處理后8h，對照組神經(jīng)上皮排列不

9、整齊，凋亡細(xì)胞數(shù)目較多，周圍間充質(zhì)凋亡細(xì)胞也較多。高溫后16h，神經(jīng)上皮細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多。與對照組相比，牡蠣保護(hù)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組鼠胚神經(jīng)上皮及其周圍間充質(zhì)在高溫處理后8h、16h細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯下降。 2．Caspase-3的免疫組化染色結(jié)果：Caspa，se-3陽性細(xì)胞散在于神經(jīng)上皮及間充質(zhì)內(nèi)，有的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒，有的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)均可見棕黃色顆粒。對照組高溫后8h、16h鼠胚神經(jīng)上皮中可見少量Ca

10、spase-3陽性表達(dá)細(xì)胞，各牡蠣保護(hù)組中神經(jīng)上皮細(xì)胞中Caspase-3呈弱陽性或陰性表達(dá)。圖像分析結(jié)果顯示，各牡蠣保護(hù)組Caspase-3陽性神經(jīng)上皮細(xì)胞OD值明顯低于相應(yīng)對照組。 3．神經(jīng)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定：培養(yǎng)24h后，出現(xiàn)大小不等的神經(jīng)球，每個(gè)球包含4-20個(gè)細(xì)胞。隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，球體逐漸增大，光滑，無明顯突起，細(xì)胞大小較均勻，折光性強(qiáng)。傳代后，細(xì)胞增殖迅速，球體也增大。免疫熒光染色結(jié)果顯示，神經(jīng)球中大多數(shù)細(xì)胞n

11、estin呈陽性反應(yīng)。 4．MTT檢測結(jié)果：與對照組Ⅰ相比，牡蠣保護(hù)組Ⅰ的神經(jīng)球無明顯差別，牡蠣保護(hù)組Ⅱ、Ⅲ的神經(jīng)球體積較大，數(shù)目較多，球體周邊呈花邊狀，球內(nèi)細(xì)胞界限清楚，折光性良好。牡蠣保護(hù)組Ⅱ、Ⅲ與對照組Ⅰ相比，MTT檢測值明顯增高，減去提取液顏色的影響后，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異顯著(P<0.05)。 5．Western blotting檢測結(jié)果：與對照組Ⅰ相比，牡蠣保護(hù)組Ⅱ、牡蠣保護(hù)組Ⅲp53表達(dá)明顯下降。 結(jié)

12、論： 1．在體內(nèi)，牡蠣提取物可減少高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形形成過程中的凋亡細(xì)胞數(shù)目，并降低凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)，故該提取物對高溫致NTD發(fā)生過程中的細(xì)胞凋亡起到一定的保護(hù)作用。 2．在體外，牡蠣提取物可增強(qiáng)高溫處理后的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖活性，并降低神經(jīng)干細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白p53的表達(dá)，故對高溫引起的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞凋亡具有一定的保護(hù)作用。 意義： 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，牡蠣提取物對高溫所致金黃地