NF-κB-p53信號通路在谷氨酸受體介導(dǎo)的自噬激活和細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：研究核因子-kB (Nuclear Factor-kappa B，NF-kB)/p53信號通路在谷氨酸受體介導(dǎo)的神經(jīng)興奮性毒性中的作用及機(jī)制。
　　 方法：采用腦立體定位紋狀體內(nèi)給藥法，建立谷氨酸受體介導(dǎo)的大鼠神經(jīng)興奮性毒性的體內(nèi)模型，RT-PCR和Western Blot檢測喹啉酸 (Quinolinic acid，QA)引起的凋亡相關(guān)蛋白——p53、PUMA、Bax、Bcl-2和自噬相關(guān)蛋白——DRAM (damage

2、-regulated autophagy modulator)、LC3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3)、Beclin1的mRNA和蛋白表達(dá)的變化。DNA ladder及尼氏染色法觀察NF-kB抑制劑SN50和p53抑制劑PFT-α (Pifithrin-alpha)對模型大鼠紋狀體神經(jīng)元的保護(hù)作用；RT-PCR和Western Blot檢測SN50和PFT-α對模型大鼠紋

3、狀體內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白p53、PUMA (p53 up-regulate modulator of apoptosis)、Bax、Bcl-2和自噬相關(guān)蛋白DRAM、LC3、Beclin1的mRNA和蛋白表達(dá)的影響。尼氏染色法觀察Cathepsin L抑制劑Z-FY-DMK對模型大鼠紋狀體神經(jīng)元的保護(hù)作用；免疫組織化學(xué)法檢測Z-FY-DMK對模型大鼠紋狀體內(nèi)NF-kB激活的影響；Western Blot檢測Z-FY-DMK對模型大鼠紋狀體內(nèi)I

4、kBα (inhibitor of NF-kB，alpha isoform)、p-IkBα (phospho-IkB alpha)、自噬相關(guān)蛋白DRAM、Beclin1、P62蛋白表達(dá)的影響。采用谷氨酸處理原代培養(yǎng)的大鼠胎鼠紋狀體神經(jīng)元，建立谷氨酸受體介導(dǎo)的神經(jīng)興奮性毒性的體外模型，LDH法檢測SN50、PFT-α、Z-FY-DMK對神經(jīng)元存活率的影響；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測SN50和PFT-α對谷氨酸引起的線粒體膜電位的影響；Wester

5、n Blot檢測Z-FY-DMK對興奮性毒性細(xì)胞模型中自噬相關(guān)蛋白Beclin1和P62蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)成功建立了大鼠神經(jīng)興奮性毒性的體內(nèi)模型。RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，模型大鼠紋狀體內(nèi)p53、PUMA、Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)降低和DRAM、LC3、Beclin1表達(dá)上調(diào)。SN50、PFT-α給藥組與模型組相比，DNA ladder凋亡條帶明顯減弱，損傷面積顯著減小 (p<0.0

6、1)；RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示SN50和PFT-α可對抗QA模型大鼠紋狀體中p53、PUMA、Bax上調(diào)、Bcl-2下調(diào)、DRAM、LC3、Beclin1上調(diào)。Z-FY-DMK給藥組與模型組相比，損傷面積顯著減小 (p<0.01)；免疫組化結(jié)果顯示Z-FY-DMK可抑制QA模型大鼠紋狀體內(nèi)NF-kB的核轉(zhuǎn)位；Western Blot結(jié)果顯示Z-FY-DMK可對抗QA模型大鼠紋狀體中IkBα降解和磷酸化、以及DRAM

7、、Beclin1上調(diào)和P62的下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)成功建立了大鼠胎鼠的原代紋狀體神經(jīng)元興奮性毒性的體外模型。LDH法結(jié)果顯示SN50、PFT-α、Z-FY-DMK可減少谷氨酸引起的神經(jīng)元死亡；免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)果顯示SN50和PFT-α可抑制谷氨酸受體介導(dǎo)的線粒體膜電位下降；Western Blot結(jié)果顯示Z-FY-DMK可對抗谷氨酸引起的Beclin1和P62蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)論：谷氨酸受體介導(dǎo)的神經(jīng)興奮性毒性中，NF-kB抑制