肝癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄因子的研究及其意義.pdf

1、原發(fā)性肝癌是一種病死率很高的惡性腫瘤，是世界第三位、中國第二位的腫瘤死亡原因。手術治療仍是目前肝癌最有效的治療方法，但即使是根治術后5年轉(zhuǎn)移復發(fā)率仍高達60-70％，因此術后高轉(zhuǎn)移復發(fā)率是影響肝癌病人長期生存的關鍵。腫瘤轉(zhuǎn)移是多基因參與，受多種信號轉(zhuǎn)導蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控的一個復雜過程。轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控中起重要作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子在一些腫瘤中表達及活性均明顯異常，并且參與調(diào)控腫瘤細胞增殖、侵襲、血管生成等多種生物學

2、功能。但目前轉(zhuǎn)錄因子的研究多集中在基因、蛋白表達水平，缺乏系統(tǒng)性轉(zhuǎn)錄因子功能研究，轉(zhuǎn)錄因子活性芯片的出現(xiàn)使系統(tǒng)研究轉(zhuǎn)錄因子活性與肝癌轉(zhuǎn)移的關系成為可能。本課題第一部分擬用轉(zhuǎn)錄因子活性芯片分析不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞系細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子活性的差異，篩選與肝癌轉(zhuǎn)移相關的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，為肝癌轉(zhuǎn)移復發(fā)研究提供新的預測指標和干預靶點。 干擾素α是目前臨床應用的能有效抑制肝癌轉(zhuǎn)移復發(fā)的為數(shù)不多的藥物之一。我所前期研究結(jié)果表明，干擾素α可抑制裸鼠

3、肝癌的生長和轉(zhuǎn)移，其作用機制是可能是通過下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的轉(zhuǎn)錄和表達、進而抑制腫瘤血管生成發(fā)揮作用，但具體機制仍不是很清楚。有研究表明轉(zhuǎn)錄因子Spl在VEGF基因調(diào)控中占有重要地位，本課題第二部分擬用VEGF啟動子報告基因分析Spl在干擾素α抑制高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞VEGF轉(zhuǎn)錄的作用，進一步研究干擾素α抑制肝癌血管生成和轉(zhuǎn)移的作用機制，以便進一步提高干擾素預防轉(zhuǎn)移復發(fā)的臨床療效。 第一部分肝癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄因子分析及

4、活性差異轉(zhuǎn)錄因子的功能研究 我所前期已建成具有不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細胞模型體系。具有相似的遺傳背景，但轉(zhuǎn)移潛能具有明顯的差別，是較好的對照研究系統(tǒng)。本課題第一部分對不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞系細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子進行了活性差異分析，篩選與肝癌轉(zhuǎn)移相關的轉(zhuǎn)錄因子，并對篩選出來的轉(zhuǎn)錄因子進行了功能分析。我們首先應用轉(zhuǎn)錄因子活性芯片技術，在功能水平對三種不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞系Hep3B(無明顯轉(zhuǎn)移潛能)、MHCC97L(低轉(zhuǎn)移潛能)和MHC

5、C97H(高轉(zhuǎn)移潛能)細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子活性譜進行差異分析，篩選出7個轉(zhuǎn)錄因子活性差異與人肝癌細胞轉(zhuǎn)移潛能變化一致，其中有5個轉(zhuǎn)錄因子活性與肝癌細胞轉(zhuǎn)移潛能呈正相關，包括p53、缺氧誘導因子．1α(ⅢF．1α)、核因子κb(NF-~cb)、信號傳導及轉(zhuǎn)錄活化因子3(Stat3)和Spl；2個轉(zhuǎn)錄因子活性與肝癌細胞轉(zhuǎn)移潛能呈負相關，包括Rb和Smad3，其中轉(zhuǎn)錄因子Spl的活性差異采用凝膠電泳遷移率變動分析(EMSA)證實其活性與肝癌細胞轉(zhuǎn)

6、移潛能密切相關；接下來我們應用蛋白免疫印跡(Westernblot)和實時定量PCR(Real-TimePCR)又在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平和翻譯后修飾水平進行了進一步分析，結(jié)果顯示Spl蛋白表達量和mRNA均隨著轉(zhuǎn)移潛能升高而顯著增高，而Spl蛋白磷酸化水平差異更為明顯，這說明Spl在肝癌組織中的過度表達和磷酸化異常是Spl活性異常的原因，且與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關，提示Spl可作為肝癌病人轉(zhuǎn)移潛能的預測指標；最后我們采用RNA干擾技術沉默Spl的基

7、因表達，從而抑制Spl蛋白表達，并進而抑制Spl的活性，體外細胞生長抑制實驗(MTT)實驗顯示，轉(zhuǎn)染了SplsiRNA后，高轉(zhuǎn)移潛能的MHCC97H細胞的生長能力較空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA組有所下降，但沒有顯著性差異。而體外侵襲實驗(Matrigel侵襲實驗)表明抑制了Spl的表達和活性后可明顯降低肝癌細胞體外侵襲能力。提示特異性抑制Spl活性或表達可抑制肝癌的侵襲性，進而抑制肝癌的轉(zhuǎn)移復發(fā)。 第二部分干擾素α抗肝癌轉(zhuǎn)

8、移的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究 干擾素α是目前臨床應用的能有效抑制肝癌轉(zhuǎn)移復發(fā)的為數(shù)不多的藥物之一。我所前期工作已證實干擾素α可抑制VEGF的轉(zhuǎn)錄和表達、進而抑制VEGF介導的腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移，但具體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制仍不清楚。有研究表明轉(zhuǎn)錄因子Spl在VEGF基因調(diào)控中占有重要地位，本課題第擬用VEGF啟動子報告基因分析Spl在干擾素α抑制高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞VEGF轉(zhuǎn)錄的作用，進一步研究干擾素α抑制肝癌血管生成和轉(zhuǎn)移的作用機制。首先我們構(gòu)

9、建VEGF全長啟動子及5’端缺失突變體報告基因分析干擾素α對高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞(MHCC97H)的VEGF轉(zhuǎn)錄活性的作用，發(fā)現(xiàn)VEGF啟動子上．109／-61區(qū)域是干擾素α抑制VEGF轉(zhuǎn)錄的最主要的調(diào)控區(qū)域，用轉(zhuǎn)錄因子活性芯片檢測結(jié)合于VEGF啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子的活性，篩查出9個轉(zhuǎn)錄因子受到干擾素α作用，其中只有Spl在．109／-61區(qū)域內(nèi)有結(jié)合位點，進一步用不同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點點突變報告基因分析干擾素α對VEGF轉(zhuǎn)錄的作用，確定在此

10、區(qū)域上的四個Spl結(jié)合位點是干擾素α最主要的作用位點。我們應用RNA干擾技術發(fā)現(xiàn)下調(diào)Spl的表達和活性后使干擾素α幾乎喪失抑制VEGF轉(zhuǎn)錄的作用。接下來我們用凝膠電泳遷移率變動分析(EMSA)確定轉(zhuǎn)錄因子Spl可特異性結(jié)合于VEGF啟動子上，且干擾素α可明顯的下調(diào)Spl與VEGF啟動子的結(jié)合活性，并呈劑量依賴性。說明干擾素α抑制VEGF轉(zhuǎn)錄的作用是通過下調(diào)Spl活性起作用的。應用Westernblot分析干擾素α對MHCC97H細胞核內(nèi)

11、Spl蛋白含量和磷酸化的作用，顯示干擾素α明顯下調(diào)了MHCC97H肝癌細胞核內(nèi)Spl的含量和磷酸化程度，其中磷酸化水平下調(diào)更為明顯，說明干擾素α是通過下調(diào)Spl在細胞核內(nèi)含量和磷酸化程度抑制其與VEGF啟動子上．109／-61區(qū)域的四個Spl結(jié)合位點的結(jié)合活性，從而達到抑制VEGF介導的腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移的。因此，我們可以說Spl在干擾素α抗肝癌血管生成和轉(zhuǎn)移中起重要的調(diào)控作用，提示Spl可作為干擾素α臨床療效的預測指標。 結(jié)論

12、 1．轉(zhuǎn)移潛能不同肝癌細胞的轉(zhuǎn)錄因子活性譜存在顯著差異。 2．活性差異轉(zhuǎn)錄因子Spl的活性、蛋白表達及磷酸化水平與肝癌轉(zhuǎn)移潛能密切相關。 3．干擾素α抑制VEGF介導的肝癌血管生成并由此抑制轉(zhuǎn)移復發(fā)，主要是通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Spl的表達或磷酸化，從而抑制其與VEGF啟動子結(jié)合的活性而完成的。Spl在干擾素α抗肝癌血管生成和轉(zhuǎn)移中起重要的調(diào)控作用。 潛在臨床應用價值 1．不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞的活性差異

13、轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)，有助于進一步了解肝癌轉(zhuǎn)移機理，從另一個視野尋找預測指標和干預靶點。 2．轉(zhuǎn)錄因子Spl的活性、蛋白表達及磷酸化水平與肝癌轉(zhuǎn)潛能密切相關，是肝癌病人轉(zhuǎn)移復發(fā)的潛在預測指標和干預靶點。 3．發(fā)現(xiàn)干擾素α通過下調(diào)Spl抑制VEGF的轉(zhuǎn)錄和表達，為研究干擾素α的應用指征、耐藥機制和聯(lián)合用藥提供了線索。 4．Spl在干擾素抗肝癌血管生成和轉(zhuǎn)移中起重要的調(diào)控作用，提示Spl可作為干擾素臨床療效的預測指標。