基于iTRAQ技術的脂多糖誘導早期內毒素耐受相關蛋白的篩選.pdf

1、目的：構建小鼠巨噬細胞RAW264.7內毒素耐受和膿毒癥模型，使用iTRAQ技術分析內毒素耐受狀態(tài)下與膿毒癥狀態(tài)下差異性蛋白的表達，探討早期內毒素耐受機制。
　　方法：
　　1.用含10％胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）體外培養(yǎng)小鼠巨噬細胞RAW246.7，獲取活力良好的細胞后，取對數(shù)期細胞，計數(shù)板計數(shù)，調濃度為5×105/ml，接種于6cm培養(yǎng)皿，使用隨機數(shù)字法分成2組，分別為內毒素耐受組（耐受組）和膿毒癥組，

2、兩組種板后均用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。
　　2.24h后更換培養(yǎng)液，耐受組用含10ng/ml LPS的完全培養(yǎng)基3ml，預處理細胞24h，膿毒癥組用完全培養(yǎng)基3ml培養(yǎng)24h，24h后兩組再次更換培養(yǎng)液，用含100ng/ml LPS的完全培養(yǎng)基刺激細胞4h、24h；
　　3.刺激4h后，（1）離心，取細胞沉淀，于-80℃冰箱保存，收集培養(yǎng)液上清，在實驗過程中顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)變化并拍照。（2）取培養(yǎng)液上清液行ELISA檢測

3、TNF-α、IL-6、IL-10。（3）流式細胞術檢測巨噬細胞膜上CD16/32表達。（4）提取蛋白，進行iTRAQ標記，篩選出差異蛋白，然后使用生物信息學分析（GO注釋、KEGG信號通路，蛋白網絡互作圖、韋恩圖）。
　　4.刺激24h后，用流式細胞術檢測巨噬細胞膜上CD16/32表達。
　　5.細胞處理及樣本留取采用3次生物學重復，收集和統(tǒng)計數(shù)據，分析結果。
　　結果：
　　1.耐受組預處理后較膿毒癥組巨噬細胞

4、活化明顯，伸出偽足，表面積變大，貼壁更緊密。
　　2.ELISA檢測細胞因子濃度：耐受組刺激4h時細胞上清中TNF-α水平(18273.5±10154.4pg/ml)較膿毒癥組(133233.7±68955.9pg/ml)明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義，P值<0.05，且細胞上清中IL-6水平(1549.8±399.2pg/ml)較膿毒癥組(3175.8±959.0pg/ml)明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義，P值<0.05；但IL-10水

5、平(351.1±184.2pg/ml)較膿毒癥組(220.3±121.4pg/ml)略有升高，無統(tǒng)計學差別，P值>0.05。
　　3.流式細胞術檢測巨噬細胞膜上CD16/32表達：耐受組刺激4h后細胞表面CD16/32陽性率(75.33%)較膿毒癥組(49.69%)高，P<0.05；刺激24h細胞表面CD16/32陽性率(79.07%)較膿毒癥組(94.27%)低，P<0.05，但與陰性對照組(54.11%)相比，膿毒癥組和耐受組

6、CD16/32均增高，P<0.05。
　　4.刺激4h后，用iTRAQ技術分析，兩組共鑒定到4086個蛋白，而耐受組與膿毒癥組的總蛋白比較，有63個顯著差異表達蛋白，其中36個上調（比值>1.2），27個蛋白下調（比值<0.833）。
　　結果：
　　1.GO注釋：差異蛋白的生物學過程主要參與器官組織生長發(fā)育、生物質量調節(jié)、外界刺激反應；分子功能主要是氧化還原酶激活、受體連接、DNA連接、抗氧化活性；細胞組分涉及染色質

7、、胞外區(qū)、膜小泡、細胞質囊泡。
　　2.KEGG信號通路分析63個差異蛋白共獲得112條信號通路，其中P<0.05的信號通路有27條，主要有TLR信號通路、NF-κB信號通路和TNF信號通路以及PPAR信號通路。
　　3.蛋白互作網絡圖中見HMGA1、HMGA2、HMGB1、HMGB2蛋白存在相互關聯(lián)。
　　4.韋恩圖中完全重疊部分共有差異蛋白35個，其中21個蛋白上調，14個蛋白下調。
　　結論：
　　1

8、.初始10ng/ml LPS預處理24小時，隨后100ng/ml LPS刺激4小時能誘導出巨噬細胞早期內毒素耐受模型。
　　2.在內毒素耐受早期狀態(tài)時促炎因子TNF-α、IL-6表達降低，IL-10水平略有升高。
　　3.使用iTRAQ技術能鑒定出蛋白并進行早期內毒素耐受差異蛋白的篩選，生物信息學對這些可能與早期內毒素耐受相關的蛋白進行分析，有助于總結可能參與內毒素耐受的蛋白的功能、所在的細胞成分及蛋白間相互聯(lián)系、可能相關的